醋酸脱氧皮质酮(DOCA)加高盐诱导动脉瘤发生发展的作用及潜在机制

吴献贤刘 星张 娜李雨涵杜星辰杨志伟*

(1.中国医学科学院医学实验动物研究所, 北京协和医学院比较医学中心, 国家卫生健康委员会人类疾病比较医学重点实验室, 北京 100021； 2.北京市人类重大疾病实验动物模型工程技术研究中心, 北京 100021；3.宁夏医科大学,银川 750004)

动脉瘤为主动脉的病理性扩张,扩张的主动脉直径超过正常动脉直径的50%即可被定义为动脉瘤。 根据动脉瘤出现的解剖位置不同,可分为胸主动脉瘤(thoracic aortic aneurysm, TAA)和腹主动脉瘤(abdominal aortic aneurysm),其中腹主动脉瘤最为常见[1]。 AAA 的发生与衰老,性别,动脉粥样硬化和吸烟有关,但与遗传关联较弱。 动脉瘤破裂是动脉瘤最危险的并发症,是引发致死的主要原因[2]。 当前,开放手术修复和血管内修复是唯一被广泛使用的治疗主动脉瘤的方法,尚无用于治疗这种破坏性疾病的有效药物[3-4]。 尽管对于AAA 的研究已长达数十年,但AAA 的发病机制并不十分清楚。 因此,阐明这种疾病的分子基础,找到新的治疗靶点,开发有效抑制动脉瘤发生发展的有效药物仍是动脉瘤研究的重点问题。

实验动物模型是研究动脉瘤发病机制、开发有效治疗药物的重要工具。 通过遗传操作或化学试剂诱导的多种主动脉瘤小鼠模型广泛应用于动脉瘤相关研究中。 这些动物模型和人类动脉瘤相比,都有其相应的缺点,比如常用的血管紧张素II 诱导的小鼠动脉瘤模型就需要在ApoE 或者是LDLR 敲除的背景下实现[5]。 近年来有研究报道给予醋酸脱氧皮质酮(DOCA)或醛固酮加高盐处理三周能诱导10 月龄小鼠动脉瘤的形成,并且该方法诱导的动脉瘤和人类动脉瘤有很多相似之处[6]。 尽管该模型强调了盐皮质激素受体激动剂及高盐在动脉瘤中的作用[7],但是关于其内在机制有待探究,并且DOCA 加高盐诱导动脉瘤的形成是否和诱导时间有关也许进一步验证。

因此,本研究采用10 月龄C57BL/6J 小鼠,并通过DOCA 加高盐分别处理一周,两周,三周,观察DOCA 加高盐处理不同时间对动脉瘤形成的影响,并检测不同时间点动脉病理结构变化,炎症细胞浸润情况,炎症因子的表达,并通过RNA 测序找到差异表达的基因及相关信号通路。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF 级雄性C57BL/6J 小鼠,120 只,10 月龄,体重(30±5)g,由北京维通利华实验动物中心提供[SCXK(京)2016-0009]。 实验动物在中国医学科学院医学实验动物研究所屏障环境动物设施中开展[SYXK(京)2015-0035]。 与实验动物相关的操作已获得中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会的批准( ILASYZW2017007)。 实验过程中严格遵循使用实验动物的3R 原则,给予人道主义关怀。

1.2 主要试剂与仪器

DOCA 缓释药片(50 mg,21 d 释放)购自美国Innovative Research of America；CD3 单克隆抗体(sc- 20047) 购 自 美 国 Santa Cruz 公 司； CD68(ab201340)单克隆抗体购自英国abcam,ly6B.2(MCA771GA)单克隆抗体购自美国BIO-RAD；荧光二抗Goat Anti-Mouse IgG H＆L (Alexa Fluor® 488)(ab150113)、 Goat Anti-Rat IgG H＆L (Alexa Fluor®488) (ab150157) and Goat Anti-Rabbit IgG H＆L(Alexa Fluor ® 568) (ab175471) 均 购 自 英 国abcam；Masson 染色试剂盒及弹力纤维试剂盒均购自中国北京索莱宝；兔超敏二步法试剂盒购自中国中杉金桥(PV9001)；DAB 显色试剂盒购自中国中杉金桥(ZLI-9019)；PCR 引物及TRIzol 购自美国Invitrogen 公司；DEPC 水购自美国QIAGEN 公司；PCR 仪购自美国Bio-Rad 公司；RNA 反转录试剂盒PrimeScriptTMRT Master Mix (RR036A)购自日本TaKaRa 公司。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组

将10 月龄C57BL/6J 小鼠随机分为两组：高盐组(HS),DOCA 加高盐组(DOCA+HS)。 DOCA 给药方式为背部皮下植入DOCA 缓释药片(50 mg,21 d 释放),高盐给予方式为盐水喂养(含0.9% NaCl和0.2% KCl 的水)。 各组在经过不同处理1 周,2周,3 周时分别取20 只小鼠采用异氟烷麻醉后进行小动物超声并取材。

1.3.2 小动物超声

给药结束后,小鼠采用2%异氟烷吸入麻醉,使用脱毛膏将小鼠腹部毛发去除。 将小鼠仰卧位固定,在其腹部涂抹超声透射凝胶。 将探头置于腹部,轻微调整探头以找到腹主动脉肾上节段,获取相同节段M 型动脉超声图像,使用“门三联征”(肝动脉,肝静脉和胆管)作为解剖标记,以评估每只小鼠相同位置的横断面图像。 测定并统计各组小鼠肾上腹主动脉处血管内径。

1.3.3 HE 染色

染色前,将组织切片用二甲苯彻底脱蜡,经过梯度乙醇(无水乙醇,95%,80%)水洗后,再用水洗。然后用苏木精染液染3 ～5 min,自来水洗1 min 后,用75%盐酸乙醇液分化数秒钟,后使用蓝化液返蓝,然后用0.5%伊红水溶液染色1 min,经乙醇脱水,二甲苯透明后,中性树胶封片。

1.3.4 Masson 染色

染色前,将石蜡切片常规脱蜡至水。 采用改良Masson 三色染色液试剂盒对动脉组织中的胶原纤维进行染色,染色后胶原纤维呈蓝色,肌纤维和细胞质呈红色。

1.3.5 EVG 染色

染色前,将石蜡切片常规脱蜡至水。 采用Weigert 弹力纤维染色液试剂盒对主动脉壁的弹力纤维进行染色,观察各组弹力纤维的断裂情况。

1.3.6 免疫组织化学法

将小鼠腹主动脉组织用10%福尔马林固定,固定后用石蜡包埋。 包埋后的组织块进行切片(4 μm),之后将组织切片用二甲苯脱蜡后在不同浓度梯度乙醇溶液中由高向低浸泡浸水,并使用0.3%H2O2阻断内源性过氧化物酶活性。 然后用0.5%triton 敷育15 min 进行破膜,0.01 mol/L 的柠檬酸缓冲液(pH 6.0)修复抗原。 用羊血清封闭非特异性结合位点,然后用目标单克隆抗体(α-SMA)杂交,4℃温育过夜。 用超敏二步法试剂盒孵育后DAB 显色试剂盒镜下显色,苏木素染色,镜下观察。对于检测炎症细胞浸润的免疫荧光实验,无需采用H2O2阻断内源性过氧化物酶,并且和相应的目标抗体杂交之后,采用荧光二抗进行敷育,DAPI 染核后封片,镜检。

1.3.7 RT-PCR

取少量动脉组织放入1.5 mL EP 管中,加入100 μL TRIzol, 用电动研磨棒研磨均匀后加入900 μL TRIzol 混匀,之后加入200 μL 氯仿,充分上下颠倒混匀后,冰上静止3～5 min,13500 r/min,4℃离心15 min,取上清。 加入500 μL 异丙醇混匀后,冰上静置10 min,13500 r/min离心10 min 弃上清。 加入1 mL DEPC 水稀释的75%的乙醇,4℃, 12 000 r/min, 离心5 min, 弃上清,得RNA 沉淀。 将RNA 沉淀充分晾干后,加入适量的DEPC 水稀释。 使用RNA 反转录试剂盒将RNA 逆转录为cDNA,并用One-stop PCR 仪检测相应基因的mRNA 表达水平。采用2-△△CT方法检测各个基因的相对表达水平。 本研究所用引物见表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.3.8 转录组测序

采用TRIzol 法提取小鼠(HS 和DOCA+HS 处理3 周的小鼠)腹主动脉节段总RNA,利用Qubit 3.0进行RNA 定量,Agilent 2100 生物分析仪评估RNA提取质量。 之后进行普通转录组建库,文库质检合格后,对文库进行pooling,选择Novaseq6000 上机测序。 测序实验及初步分析由北京基石生命科技有限公司进行。 以｜logFC ｜≥2 和Padj＜0.005 为阈值筛选差异表达的基因,并对差异表达的基因进行功能注释。

1.4 统计学方法

采用Graphpad Prism 7.0 软件对数据进行统计分析,数据表示为平均数±标准误差()。 两组间比较采用Student'st检验,两个因素的多重比较采用双因素方差分析。 每组小鼠的存活率和成瘤率采用卡方检验。P＜0.05 认为差异具有显著性。

2 结果

2.1 DOCA 加高盐处理不同时间对动脉瘤的诱导作用

小鼠腹主动脉超声结果显示,DOCA 加高盐处理一周并未引起腹主动脉内径的扩张,处理两周时可见腹主动脉扩张,处理三周时腹主动脉扩张更为明显(图1A),对主动脉进行拍照,并测量其外径,统计动脉瘤发生率,发现DOCA 加高盐处理一周未引起小鼠动脉主动脉外径的扩张和瘤的形成,而处理两周时主动脉明显扩张,此时动脉瘤成瘤率为44%；处理三周后主动脉外径增加更为明显,此时动脉瘤成瘤率为65%(图1B～1D)。

2.2 DOCA 加高盐处理不同时间对胶原沉积、弹力纤维断裂和平滑肌细胞降解的影响

本研究进一步对小鼠主动脉病理表型进行分析,HE 染色结果显示DOCA 加高盐处理两周的小鼠出现了明显的夹层动脉瘤,并且动脉外壁可见少量炎症细胞,处理三周后夹层动脉瘤进一步扩大,动脉外壁见大量炎症细胞(图2A)。 Masson 染色结果显示DOCA 加高盐处理一周和两周并没有影响动脉外壁胶原沉积量,而处理三周后胶原沉积量有少量增多趋势(图2B)。 弹力纤维染色结果显示,DOCA 加高盐处理一周和两周时均未引起弹力纤维的断裂,而处理三周时可见弹力纤维断裂现象(图2C)。 免疫组化结果显示,DOCA 加高盐处理一周时,平滑肌细胞结构完整,而处理两周后α-SMA 出现大量降解, 三周后降解丢失现象更为明显(图2D)。

2.3 DOCA 加高盐处理不同时间促进动脉组织炎症细胞浸润和炎症因子的表达

之后检测了动脉组织中浸润的炎症细胞类型,图3A～C显示DOCA 加高盐处理一周时动脉组织中未见CD3+T 细胞,CD68+巨噬细胞和LY6B.2+中性粒细胞的浸润,处理两周时可见这三种类型细胞的浸润,处理三种时浸润的细胞进一步增多,其以CD3+T 细胞核CD68+的巨噬细胞为主,LY6B.2+中性粒细胞的浸润较少。 进一步检测动脉组织中炎症因子的表达发现,DOCA 加高盐处理能促进炎症因子(TNF-α,IL-1β,IL-6 和CCL-2)的表达,而抑制抗炎性因子(IL-10 和IL-13)的表达,且这种促进或抑制作用与处理时间高度相关(图3D)。

图1 DOCA 加盐处理不同时间对动脉瘤形成的影响Note.HS,high salt.DOCA, Deoxycorticosterone acetate.A, Representative ultrasound images of abdominal aorta.B, Representative photographs of aortas.C,Quantification of the external diameter of abdominal aorta.Compared with HS group at the same time point,two-way ANOVA, *P＜0.05.D, The aortic aneurysm incidence, chi-square test, **P＜0.01, ***P＜0.001.Figure 1 Effect of DOCA plus salt on the induction of aortic aneurysm in aged mice at different time points

图2 DOCA 加高盐处理不同时间对主动脉病理结构的影响Note.α-SMA, α-smooth muscle actin.A, HE staining representative image.B, Masson staining representative image.C, Elastin staining representative image.D, α-SMA immunohistochemical representative image.Figure 2 Effect of DOCA plus salt on the vascular pathology of aged mice at different time points

2.4 RNA 测序分析DOCA 加高盐处理三周小鼠动脉组织中差异表达基因的变化

为了进一步探究DOCA 加高盐诱导小鼠动脉瘤发生的分子机制,我们对DOCA 加高盐处理三周小鼠的腹主动脉组织RNA 进行测序分析,并和HS组进行比较。 图4A 为差异表达基因的热图结果,图4B 为差异表达基因的通路富集结果,可见上调基因主要富集在免疫、代谢、止血和中性粒细胞降解等途径中,而下调基因则主要富集在信号传导、脂质代谢、蛋白质代谢和免疫系统。 图4C 为止血、免疫、细胞外基质重构通路中的一些差异表达基因的热图。 从中我们发现和炎症反应密切相关的,介导白细胞与内皮粘附的关键分子P-选择素糖蛋白配体-1(PSGL-1)的表达明显升高。

3 讨论

主动脉瘤根据发病位置可分为胸主动脉瘤(TAA)和腹主动脉瘤(AAA)。 TAA 发生在所有年龄段的人,男女发病率相似,并且与遗传因素高度相关。 相反,AAA 的发生与衰老,男性,动脉粥样硬化和吸烟有关,但与遗传关联较弱[8]。 小鼠腹主动脉瘤动物模型是研究腹主动脉瘤的重要工具,对阐释腹主动脉瘤的病理生理学机制,研发和评价主动脉瘤的治疗药物都具有重要意义[9]。 本研究采用DOCA 加高盐诱导腹主动脉瘤,结果发现DOCA 加高盐处理不同时间对动脉瘤的形成有不同的效果,DOCA 加高盐处理一周并不能诱导动脉瘤的生成,处理两周时有小鼠开始形成动脉瘤,并且形成的动脉瘤不止局限于腹主动脉节段,胸主动脉也可见明显的动脉瘤夹层。 DOCA 加高盐处理三周时动脉瘤的发病率进一步升高,但是我们并没有进一步延长处理时间观察更长时间处理对动脉瘤发病率的影响。 因为三周时,开始有小鼠因为动脉瘤破裂死亡,死亡率高达35%。 进一步延长处理时间在增加小鼠成瘤率的同时,也必然加剧动脉瘤破裂的风险。

在病理学上,AAA 的特征是动脉壁各层扩张,这可归因于弹性蛋白的断裂,平滑肌细胞凋亡,胶原蛋白的代偿性沉积,炎症细胞的浸润,氧化应激等[10-11]。 我们的研究发现,DOCA 加高盐处理两周时虽然有小鼠开始形成动脉瘤,但此时胶原纤维沉积并没有变多,弹性纤维也未出现断裂,直到处理三周时才可见大量平滑肌细胞降解,胶原纤维沉积和弹性纤维断裂现象,此结果提示弹力纤维断裂和动脉瘤形成可能并不是因果关系,有可能是动脉瘤形成后才出现弹力纤维的断裂,从而促进动脉管壁的进一步扩张。 而胶原纤维的沉积也是一种代偿性沉积,当DOCA 处理两周时虽然已经有胶原纤维的产生,但此时机体产生的蛋白水解酶可以降解这些胶原纤维,所以并未见大量胶原纤维沉积现象。而处理三周时,机体产生的蛋白水解酶不足以降解产生的胶原纤维,导致胶原纤维沉积增多。

以往研究表明炎症在动脉瘤的发生发展中具有重要意义,慢性主动脉炎症所导致的一系列蛋白水解酶(例如基质金属蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶)的释放,以及氧化性自由基,炎症因子的生成是引起主动脉中膜破坏以及血管平滑肌细胞凋亡和功能障碍的原因[12-13]。 炎症反应的发生离不开炎症细胞的浸润,浸润的炎症细胞包括T 细胞,B 细胞,巨噬细胞,粒细胞[14-15]。 我们的HE 染色结果初步显示DOCA 加高盐处理三周后动脉外壁有大量炎症细胞浸润。 进一步的研究发现浸润的炎症细胞以T 细胞和巨噬细胞为主,也有少量的粒细胞。DOCA 加高盐处理一周、两周和三周均能够增加动脉组织炎症因子表达水平,降低抗炎因子表达水平,但是只有在处理三周时这种变化才有显著意义。 值得注意的是,虽然DOCA 加高盐处理一周并没有诱导动脉瘤的形成,但此时动脉组织中炎症因子的表达已出现增加趋势,抗炎因子的表达出现降低趋势,提示DOCA 加高盐诱导的炎症反应在其诱导的动脉瘤发生中起着重要的作用。

本研究进一步的RNA 测序分析结果表明DOCA 加高盐处理三周组和高盐处理三周组相比,其差异表达的基因主要富集在免疫系统、信号传导、代谢、止血等信号通路中,其中我们发现止血通路中的一个基因P-选择素糖蛋白配体-1(PSGL-1)在DOCA 加高盐处理三周后表达明显增加,PSGL-1和炎症的发生密切相关,在各种白细胞表面广泛表达,是介导炎症反应的起始步骤[16-18],我们以往的研究发现PSGL-1 和盐敏感性高血压的发生发展密切相关[19-20],但是关于PSGL-1 在动脉瘤中的作用还未见报道,探究PSGL-1 和动脉瘤发生发展的关系是我们今后研究的方向。

图3 DOCA 加盐处理不同时间对炎症细胞浸润和炎症因子表达的影响Note.A, CD3+T cells infiltration in arterial tissue.B, CD68+ macrophage infiltration in arterial tissue.C, LY6B.2+ granulocyte infiltration in arterial tissue.D, The mRNA expression levels of inflammatory factors and anti-inflammatory factors.Compared with HS group at the same time point, two-way ANOVA, *P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001.Figure 3 Effect of DOCA plus salt on inflammatory cells infiltration, and on the expression of inflammatory cytokines of mice at different time points

图4 RNA 测序分析结果Note.A, Heat map.B, GO enrichment analysis.｜logFC ｜≥2 and Padj＜0.005.C, Heatmap displaying some key differentially expressed genes enriched in hemostasis, immune system and extracellular matrix organization pathways.Figure 4 RNA sequence analysis result