左归丸对磷酰胺氮芥体外诱导损伤颗粒细胞自噬与凋亡的影响

孙晓峰刘 涛曾贵荣陈勇超伍参荣乔 江

(1.湖南中医药大学医学院组织学与胚胎学教研室,长沙 410208； 2.湖南中医药大学医学院临床医学专业,长沙 410208； 3.湖南省药物安全评价研究中心＆新药药效与安全性评价湖南省重点实验室,长沙 410331；4.湖南中医药大学医学院免疫学教研室,长沙 410208； 5.湖南中医药大学附属第一医院妇产科,长沙 410007)

卵巢早衰(Premature ovarian failure,POF)是指各种因素导致的女性卵巢储备功能下降,由此引发提前绝经(40 岁之前)以及低雌激素、高促性腺激素症状。 近年来医源性因素逐渐发展为POF 的重要因素[1-2],化疗为其中之一,常见药物有环磷酰胺(cyclophosphamide,CTX)、顺铂等。 化疗所造成的POF 给女性患者带来严重的生理问题和心理困扰[3]。 因此,如何恢复化疗后女性卵巢功能,从而提高患者生存质量显得尤为重要。 颗粒细胞围绕在卵母细胞周围,不仅为卵母细胞提供营养支持,而且对卵泡的发育和成熟起重要作用[4-5]。 大量研究证实：CTX 在体内被激活成具有活性的细胞毒性代谢物丙烯醛和PM,通过形成共价DNA 加合物造成DNA 结构破坏,从而阻断DNA 复制,抑制细胞的增殖,甚至诱导其凋亡。 左归丸是中医妇科临床治疗POF 的常用方药,临床多以其为基本方加减。 本课题组前期药效学研究的卵巢组织免疫组化检测结果显示：在体内动物实验中,左归丸降低了化疗源性POF 小鼠颗粒细胞凋亡[6]。 自噬与凋亡能通过多种通路相互协调转化,共同促进细胞死亡,而目前关于CTX 损伤颗粒细胞以及左归丸保护颗粒细胞的机制中是否存在自噬过程的研究甚少。 本实验以PM(CTX 的体外活性成分)建立化疗源性体外颗粒细胞损伤模型,通过流式细胞术和Western blot 检测各实验组颗粒细胞凋亡率及自噬与凋亡相关蛋白如卵巢自噬启动因子Beclin-1、微管结合蛋白轻链3(LC3BI/LC3BII)、自噬受体蛋白P62、凋亡蛋白Bax、Caspase3 的表达,进一步探讨CTX 的活性成分——PM 建立体外诱导颗粒细胞损伤模型以及左归丸含药血清对颗粒细胞损伤的保护作用及相关机制,为进一步揭示此过程中是否存在自噬与凋亡的交叉对话关系奠定基础,以期为临床靶向治疗提供参考。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

雌性SD 大鼠60 只,SPF 级,体重250 ～270 g,8周龄,购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司[SCXK(湘)2019-0004],在湖南省药物安全评价研究中心＆ 新药药效与安全性评价湖南省重点实验室SPF 级实验室饲养[SYXK(湘)2015-0016]。 动物实验经湖南省药物安全评价研究中心伦理委员会批准(2019024),过程中遵循实验动物学的3R原则。

1.1.2 实验细胞

原代大鼠卵巢颗粒细胞,批号：iCell201910027,赛百慷上海生物技术股份有限公司产品。

1.2 主要试剂与仪器

左归丸方剂由熟地、山药、枸杞、山茱萸、川牛膝、菟丝子、鹿角胶、龟板胶组成,购自湖南中医药大学附属一医院,按照8 ∶4 ∶4 ∶3 ∶4 ∶4 ∶4 ∶4比例制成生药1 g/mL 的中药浸膏备用；PM(江苏倍达医药科技有限公司合成,批号20180908)；电泳仪,北京六一公司产品；化学发光仪,博路腾公司产品；流式细胞仪,CytoFlex 公司产品；倒置显微镜,OLYMPUS IX71 产品；Annexin V-FITC/PI 双染细胞凋亡检测试剂盒,批号：640914,Biolegend 产品；BCA 蛋白定量试剂盒,批号：P0012S,碧云天产品；RIPA 蛋白裂解液,批号：P0013B,碧云天产品；二抗：Anti Rabbit IgG/HRP,批号：AS014Abclonal 公司产品。 一抗：兔抗P62,批号：A19700、兔抗BECLIN,批号：A7353、兔抗 CASP3, 批 号： A19654、 兔 抗 BAX, 批 号：A19684、兔抗LC3B,批号：A19665,均为Abclonal 公司产品；β-actin 内参,批号：AC026, Abclonal 公司产品。

1.3 实验方法

1.3.1 造模与分组

将原代大鼠卵巢颗粒细胞接种于96 孔板中,待细胞生长至底壁的75%～80%时,将细胞分为4 组：①对照组(Control)；②模型组(M)；③左归丸含药血清组(10%ZGW)；④模型+左归丸含药血清组(M+10%ZGW)。 除对照组及左归丸含药血清组外,其余2 组每孔加入200 μL 终浓度为30 μmol/L 的PM进行处理,37℃,5%CO2细胞培养箱,培养24 h。

1.3.2 左归丸含药血清制备与给药

SD 大鼠60 只随机分为2 组：即正常血清组和ZG 血清组各30 只。 1 g/mL 的ZG 浸膏,根据成人与大鼠体表面积,换算成大鼠的用量,相当于临床等效剂量的9 倍,即按照245.7 g/(kg⋅d),每天分两次给ZG 血清组大鼠灌服,连续3 d,正常血清组给予等量纯净水,于末次灌胃后2 ～2.5 h 麻醉后腹主动脉采血,静置30 min,离心后,无菌分离血清,-20℃保存,实验前56℃30 min 灭活,0.22 μm 滤器过滤后使用。 PM 处理相应组24 h 后,Control 组及M 组加入10%正常大鼠血清；10%ZGW 组及M+10%ZGW 组加入10%左归丸含药血清,37℃,5%CO2细胞培养箱,培养24 h。

1.3.3 流式细胞术测定细胞凋亡情况

各组细胞离心收集,用4℃预冷PBS 洗涤2 次,然后用500 μL 结合缓冲液重悬细胞,调节其浓度为106/mL,取100 μL 细胞悬浮于5 mL 流式管中,加入5 μL Annexin V-APC 混匀后,再 加入5 μL Propidium Iodide 混匀,于室温避光孵育15 min,随后重悬于400 μL PBS,400 目筛网过滤,加样于流式细胞仪(FACS)检测细胞凋亡。 获得细胞凋亡数据后用ModFitLT 软件进行细胞凋亡相对定量分析。实验重复3 次,结果取3 次平均值。

1.3.4 Western blot 检测各组目标蛋白的表达

用胰酶消化好各组细胞后加入新鲜培养基,反复吹打使其脱壁并分散,制成细胞悬液,取各组适量细胞悬液置于已编号的EP 管内经1000 r/min 的速度离心5 min 后,弃去上清液,加入适量生理盐水再次离心,弃去生理盐水。 在EP 管内加入一定量RIPA 蛋白裂解液提取蛋白后,以14000 r/min 的速度离心10 min,取上清液。 按照相应的稀释倍数将上样缓冲液加入上清液中,在105℃环境中变性蛋白10 min,备用。 变性后的各组蛋白经SDS 凝胶电泳(1～2 h)、转膜(60～80 min)、封闭(30 ～60 min)、孵一抗(4℃过夜)、洗膜(10 min×3 次)、孵二抗(60 min)、再次洗膜(10 min×3 次)等步骤后,使用ECL显影液进行显影,处理图像,定性和定量分析各组条带Beclin-1、LC3B、Bax 及P62 的表达。 实验重复3 次,结果取3 次平均值。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 左归丸含药血清对颗粒细胞凋亡的影响

流式细胞仪检测凋亡结果见表1、图1。 可知：模型组较对照组颗粒细胞早期和晚期凋亡率上升,差异具有统计学意义。 而10%左归丸含药血清不仅能降低正常颗粒细胞的凋亡率,还可以降低PM诱发的卵巢颗粒细胞凋亡,且早期凋亡率有近4 倍差异,晚期凋亡率也有超过2 倍的差异,差异具有统计学意义。

2.2 左归丸含药血清对Bax、LC3B、Beclin-1、P62及Caspase3 蛋白表达的影响

如图2、表2 所示,模型组较对照组Bax、LC3B、Beclin-1 及Caspase3 蛋白表达上升,P62 蛋白表达下降,差异具有统计学意义；而10%左归丸含药血清可降低正常和受损颗粒细胞Bax、LC3B、Beclin-1及Caspase3 蛋白表达,升高正常和受损颗粒细胞P62 蛋白表达,差异具有统计学意义。

表1 左归丸含药血清对颗粒细胞凋亡的影响(,n＝3)Table 1 Effect of serum containing Zuogui Pill on apoptosis of granule cells

表1 左归丸含药血清对颗粒细胞凋亡的影响(,n＝3)Table 1 Effect of serum containing Zuogui Pill on apoptosis of granule cells

注：与对照组比较,*P ＜0.05；与模型组比较,#P ＜0.05。Note.Compared with the control group, *P＜0.05.Compared with the model group, #P＜0.05.

分组Groups对照组Control左归丸含药血清组10%ZGW模型组M模型组+左归丸含药血清组M+10%ZGW早期凋亡率(%)Early apoptosis rate 3.21±0.29 1.43±0.07* 9.12±0.84* 2.41±0.13#晚期凋亡率(%)Late apoptosis rate 31.86±2.17 9.51±0.49* 48.92±0.65* 22.44±0.50#总凋亡率(%)Total apoptosis rate 35.07±2.19 10.95±0.56* 58.04±0.90* 24.85±0.47#

图1 各组细胞周期分布Figure 1 cell cycle distribution of each group

图2 左归丸含药血清对Bax、LC3B、Beclin-1、P62 及Caspase3 蛋白表达的影响Figure 2 Effects of serum containing Zuogui Pill on protein expression of Bax, LC3B, Beclin-1, P62 and Caspase3

表2 各组目标蛋白灰度分析数值统计( ,n＝3)Table 2 Gray level analysis value statistics of target protein in each group

表2 各组目标蛋白灰度分析数值统计( ,n＝3)Table 2 Gray level analysis value statistics of target protein in each group

注：与对照组比较,*P＜0.05；与模型组比较,# P ＜0.05。Note.Compared with the control group, *P ＜0.05.Compared with the model group, #P＜0.05.

分组Groups对照组Control左归丸含药血清组10%ZGW模型组M模型组+左归丸含药血清组M+10%ZGW P62/β-actin 1.13 ± 0.22 1.70 ± 0.29* 0.69 ± 0.05* 0.92 ± 0.06#BECLIN-1/β-actin 0.94 ± 0.11 0.60 ± 0.12* 1.83 ± 0.18* 1.30 ± 0.16#CASP3/β-actin 0.91 ± 0.07 0.46 ± 0.16* 1.98 ± 0.29* 1.09 ± 0.06#BAX/β-actin 1.06 ± 0.29 0.71 ± 0.14* 2.55 ± 0.72* 1.34 ± 0.53#LC3B/β-actin 0.97 ± 0.06 0.65 ± 0.08* 1.95 ± 0.24* 1.40 ± 0.21#

3 讨论

随着肿瘤发病的年轻化以及自身免疫性疾病发病率的升高,化疗药物的使用也随之上升,由此对女性患者所带来的POF 问题引起许多学者的关注。 化疗药物对卵巢的影响主要与其对颗粒细胞和卵母细胞的损害有关,且呈剂量依赖性[7]。 CTX是基础的化疗药物,其可影响卵巢血供[8]、诱导颗粒细胞凋亡[9]以及形成卵巢氧化应激损伤[10],大多数研究集中在CTX 诱导颗粒细胞凋亡这一机制上。

细胞自噬和凋亡被认为是代表细胞死亡机制的连续部分：自噬为凋亡所必需,自噬先于凋亡,进而促进凋亡；或自噬抑制凋亡；或者自噬与凋亡共同促进细胞死亡,抑制其中之一都会转变为另一种细胞死亡途径。 自噬作为真核细胞内广泛存在的降解和再循环系统,在废物清除、结构重建、细胞生长发育、蛋白代谢平衡维持和细胞内环境稳定中起重要作用[11]。 Beclin-1 是自噬启动关键因子；LC3B是自噬体的标记蛋白,新合成的LC3B 蛋白经加工后成为LC3B-I,位于细胞质中,随后LC3B-I 与磷脂酰乙醇胺连接,通过泛素化样酶促反应成为LC3BII,与自噬体的内膜和外膜均结合,自噬体内膜的LC3B-II 在自噬溶酶体中被降解而进入再循环,LC3B 的合成、LC3B-I 到LC3B-II 的转化率是检测自噬的通用指标；自噬底物的降解通过标记细胞内部受体蛋白P62 的降解来佐证自噬的完成,P62 蛋白水平高低与自噬活性成反比,其增加提示自噬/溶酶体降解途径被抑制,其表达量变化可用于监测自噬流[12]。 研究发现自噬与凋亡存在着分子联系,在死亡受体和线粒体介导的细胞凋亡通路中,自噬的调控蛋白Beclin1 是Caspase-3、-7、-8 的剪切对象[13],而Bax 属于Bcl-2 家族成员之一,可作为Caspase-3 的上游调控蛋白,启动Caspase 级联反应[14]。 目前尚未有研究揭示PM 损伤颗粒细胞的机制中是否同时存在自噬与凋亡现象? 二者是否存在交叉对话?

中医临床上治疗POF 时针对不同病因并无特定的治疗方法,而是从辩证论治出发,以补肾填精为主、活血理气为辅,左归丸是补肾填精的主要方剂。 课题组前期研究及其他相关研究证实：以CTX为代表的一些化疗药物可通过上调Bax 蛋白的表达、下调Bcl-2 蛋白的表达、促进卵巢颗粒细胞凋亡从而造成卵巢损伤。 而左归丸可降低化疗源性POF 小鼠颗粒细胞凋亡率,保护卵巢功能[6,15-16]。本实验建立PM 体外诱导原代卵巢颗粒细胞损伤模型,使用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率并通过蛋白表达角度观察颗粒细胞中自噬相关蛋白如Beclin-1、 LC3BI/LC3BII 及 凋 亡 相 关 蛋 白 Bax、Caspase3 的表达情况。 结果显示：①模型组颗粒细胞凋亡率较对照组而言显著升高,10%左归丸含药血清可降低颗粒细胞凋亡率；②自噬相关蛋白如Beclin-1、 LC3BI/LC3BII 及 凋 亡 相 关 蛋 白 Bax、Caspase3 在PM 作用的颗粒细胞中,相对于对照组而言有高表达,10%左归丸含药血清可下调上述蛋白在模型组中的表达；然而受体蛋白P62 的表达较对照组降低,10%左归丸含药血清可上调模型组P62 蛋白的表达。 以上结果说明PM 可通过促进凋亡、激活自噬/溶酶体降解途径的机制损伤颗粒细胞；10%左归丸含药血清能缓解由此带来的损伤,同时影响了颗粒细胞自噬和凋亡过程,二者同时存在,且可能存在交叉对话。

综上所述,PM 促进了颗粒细胞的凋亡过程,与自噬相关,二者可能存在交叉对话。 左归丸含药血清抑制了化疗损伤源性卵巢颗粒细胞凋亡,降低此过程中自噬与凋亡的活性,为下一步深入探讨自噬与凋亡间交叉对话点奠定了实验基础,同时为左归丸的药效学研究提供了新的理论及实验基础,也为POF 的防治提供新理论。 如能选择性地抑制卵巢细胞的自噬与凋亡过程,保护卵巢逃避化疗药物的作用或化疗后帮助恢复卵巢功能,则能极大地造福于化疗后POF 患者,对于临床具有重要意义。