阳虚动物模型及检测指标的研究进展

吉 琳申 琪郭向东

(1.河南中医药大学第一临床医学院,郑州 450000； 2.河南中医药大学第一附属医院耳鼻喉科,郑州 450000)

阳气的生长、充盛至衰竭的过程贯穿着人体的整个生命历程,阳气对维持人体各项生理机能发挥着不可或缺的重要作用。 阳虚证是指人体阳气亏损,其温养、推动等功能减退,以畏寒肢冷为主要表现得虚寒证[1]。 为了更好的认识和了解阳虚本质,研究阳虚的病理生理机制、诊断、治疗等,复制稳定并与临床症状或机制相似的阳虚动物模型尤为重要。 随着研究的不断进展,国内外学者尝试了多种有效的造模方法并制定了相应的检测指标。 本文对当前阳虚动物模型的多种造模方法及检测指标进行归纳及综述,从不同角度揭示阳虚的发病机制,为今后寻求有效诊断方法,提高阳虚及阳虚相关疾病的诊治率,发展有效的临床治疗方案提供思路。

1 阳虚动物模型的建立

目前,建立阳虚实验动物模型的思路分别从模拟中医病因、西医病理、病证结合三个方面造模(见表1)。

1.1 模拟中医病因

此类模型按照中医病因学说,使动物在人为制造的特定致病环境中出现相应的疾病,建立与临床上某种证型表现相似的模型[2]。 模拟中医病因建立阳虚模型的方法目前包括劳倦过度,房事不节；惊恐伤肾；苦寒泻下；寒湿困脾等。

模拟中医病因建立的阳虚动物模型多以脾肾两脏为主,并且多为复合因素建模。 李震等[3]将雄雌鼠同笼喂养,雄鼠每天游泳至无力下沉时捞出,用4 周时间建立以“劳倦过度、房室不节”为病因的肾阳虚动物模型。 杜维祥等[4]通过猫吓鼠的方式建立肾阳虚模型,此法虽然遵循中医“恐伤肾”理论,但不符合实验动物伦理,且一般实验室猫、鼠共同饲养也较难实现,对实验资源有很大的浪费。 对于这一局限性,有一项研究通过避水应激建立阳虚型肠易激综合征(IBS)动物模型,利用大鼠对水的天生恐惧感模拟“恐伤肾”病因,又可诱导IBS 内脏高敏感[5]。 自然衰老也是造模的方法之一,但是此法虽然和人类阳虚发展过程最相似,但是造模时间至少1 年以上,成本大,可操作性不高[6]。 苦寒泻下法多用于建立脾阳虚,或苦寒泻下和氢化可的松结合建立脾肾阳虚模型,大黄或番泻叶为常用药物。 滕培颍等[7]就是通过此方法每天按照0.25 mL/100 g肌注氢化可的松注射液,同时以1 mL/100 g灌胃大黄水煎液,连续17 d 建立了脾肾阳虚动物模型。 寒易伤阳,湿为阴邪,阻遏气机,损伤阳气,根据这一理论,章敏等[8]的研究将大鼠放在温度区间(6±2)℃,湿度区间(90±4)%的寒湿环境中,每天放置8 h,持续30 d,大鼠出现脾阳虚症状。

1.2 模拟西医病理

病理模型是运用现代实验技术在动物身上造成特定病理过程以模拟人的病理过程的一种模型。模拟西医病理建立阳虚模型的方法包括糖皮质激素如氢化可的松；抗甲状腺素药物如他巴唑、丙硫氧嘧啶；甲状腺切除；肩胛骨间棕色脂肪组织(brown adipose tissue, BAT) 切除术；其他药物如腺嘌呤,羟基脲等以及衰老。

首先,下丘脑-垂体-靶腺轴功能紊乱是肾阳虚的病理机制之一,现代研究多通过干扰该轴的功能而建立肾阳虚动物模型。 氢化可的松是糖皮质激素,可以使下丘脑-垂体-肾上腺功能减退,抑制促肾上腺皮质激素(ACTH)的释放,邝安堃等[9]在20世纪60 年代通过“氢化可的松”首次建立了肾阳虚动物模型,动物出现畏寒肢冷,腰膝酸软,精神不振,性功能低下,被毛疏松、失去光泽等“耗竭”现象,是最常用的肾阳虚动物模型。 但有报道表明,糖皮质激素不同种类、剂量、制剂、给药方式所引起的造模结果是不同的,秦文艳等[10]的研究采用灌胃、腹腔注射及皮下注射的方式给予小鼠不同剂量(12.5、25、50 mg/kg 体重) 氢化可的松注射液9 d,结果表明灌胃给药25 mg/kg 剂量组成模率较其他组高,且各项指标均可呈现出肾阳虚的症状和体征, 是比较可靠的肾阳虚造模方法。 也有研究认为所谓的“耗竭现象”有可能是外源性糖皮质激素在体内蓄积造成机体代谢紊乱的毒性作用,所以氢化可的松等糖皮质激素具体的造模方法值得商榷。范景等[11]利用使性腺轴功能紊乱的方法制造肾阳虚模型,对雄性小鼠按0.1 mL/10 g 腹腔注射苯甲酸雌二醇(E2)大豆油稀释液,1 d1 次,连续15 d。裴妙荣等[12]和欧阳轶强等[13]分别使用抗甲状腺药丙硫氧嘧啶和他巴唑制造甲状腺功能降低的大鼠肾阳虚模型。

通过手术方式也是建立阳虚模型的方法之一,如甲状腺切除术、BAT 切除术等。 徐敏等[14]通过手术切除甲状腺的方法复制“甲低”病理模型,发现实验大鼠存在与临床相同的病理改变及常见的证候表现,并且文章中首次报导阳虚主症畏寒喜暖的定量检测装置,认为此检测方法比现在已有的耐冻实验和冰水游泳实验更能鉴别阳虚证型。 BAT 通过产热维持体温,而动物切除肩胛间BAT 后产热减少,利用这一原理韦祎等[15]通过BAT 切除术建立阳虚动物模型,结果显示动物模型效能产热温度峰值下降和产热体温曲线下面积减小,体重增长率降低,有能量代谢衰减的表现。

此外,还有通过破坏肾组织、影响肾组织能量代谢,抑制DNA 合成以及诱导衰老达到造模目的的。 有研究表明高浓度的腺嘌呤代谢产物沉积于肾小管,会因机械性阻塞肾小管和毒性作用,抑制肾组织中与物质代谢有关的酶活性,从而影响肾组织能量的代谢,造成肾功能衰竭[16]。 林海雄等[17]选用雄性SD 大鼠,皮下注射未提纯腺嘌呤,大鼠出现疲倦,饮食量减少,体重减轻等症状,以此建立大鼠阳虚模型。 邵命海等[18]比较腺嘌呤与氢化可的松两种造模方法,结果表明模型组睾酮(T)水平偏低,E2 水平偏高,前列腺腺体萎缩与精囊萎缩状态都更加明显,在体征与性激素指标方面更符合肾阳虚表现。 且有研究表明,腺嘌呤模型较氢化可的松模型阳虚症状持续时间更长,且有肾损伤,更符合理想的阳虚动物模型,腺嘌呤浓度的控制是成功构建该模型的关键[19]。 羟基脲是核苷酸还原酶抑制剂,可以抑制DNA 合成,刘福春等[20]运用不同剂量的羟基脲喂雄性小鼠,通过观察出现“阳虚”症状及死亡率,得出每只7.5 mg 的剂量最为合适。 肖凌等[21]建立D-半乳糖诱导衰老动物模,结果表明其热休克蛋白HSP70 表达下降,超氧化物歧化酶(SOD)活性下降,且与阳虚证的表现相符。

1.3 病证结合

病证结合动物模型以中医理论为指导,以西医复制疾病模型为基础,与某些致病因素相结合,建立具备西医疾病和中医证候的动物模型。 西医疾病多采用阳虚证型为主的疾病,如肾病,慢性心衰,哮喘,骨质疏松(OP),便秘,腹泻型肠易激综合征(IBS-D)等。

中医认为脾肾阳虚是微小病变肾病之本,而阿霉素(ADR)肾病模型是此病典型的动物模型,鲁艳芳等[22]仿照Bertani 等[23]方法,大鼠尾静脉一次性注射ADR 5.5 mg/kg,结果表明模型组的病理改变与临床微小病变肾病相似,症状及微观指标也与阳虚表现相符。

ADR 不仅用于建立肾病模型,有研究表明ADR由于对心肌组织的亲和力高故其心脏毒性高于其他组织[24],童妍等[25]采用大鼠腹腔注射ADR 4 mg/kg 的方法建立心阳虚型慢性心力衰竭模型,每周1 次,共6 周,此模型符合心阳虚的症候群,可能与ADR 诱导氧化应激有关。 除了通过药物建立阳虚型慢性心衰模型,还有通过手术结扎动脉的方式,如侯衍豹等[26]利用冠脉结扎结合一氧化氮合酶抑制剂建模,杨喆等[27]利用腹主动脉结扎结合寒冷刺激建模。

子病及母,肺肾为母子关系,故肾虚日久可累及于肺。 陈博武等[28]在已有哮喘大鼠肾阳虚病证结合模型基础上进行了改进[29],以1.5 mL/100 g灌胃地塞米松混悬液联合2%卵蛋白雾化吸入建立哮喘肾阳虚模型,并通过大鼠四诊信息评价建模是否成功。

陈剑磨等[30]等选用雌性KM 小鼠,应用去卵巢法构建OP 模型,按25 mg/kg 的剂量皮下注射氢化可的松诱导肾阳虚模型,该研究耗时8 周成功构建OP 肾阳虚病证结合模型,但该法只模拟了绝经后女性人群,因而研究范围比较局限。

肾主一身阴阳,开窍于二阴,主司二便,肾中元阳对脾的运化及大肠的传导功能起着推动、温煦作用,胃肠疾病与阳虚关系密切,临床研究也表明阳虚患者易患消化系统疾病[31]。 岳奇等[32]利用中医“味过于酸,脾气乃绝”理论,在以往建立阳虚便秘模型(食用白醋加活性炭冰水)文献的基础上进行了改进,即4℃食用白醋加活性炭冰水再加止泻药物复方地芬诺酯,比未改进前病理变化更明显。 韩博宇等[33]在建立脾肾阳虚型IBS-D 动物模型时,比较了三种IBS-D 造模方法(母子分离、直肠扩张、避水应激[34])联合番泻叶灌胃以及番泻叶灌胃剂量和观察周期的不同对造模结果的影响,实验结果显示,高剂量(10 g/(kg⋅d))组番泻叶灌胃6 周联合直肠扩张组复制的病证结合模型最好,体现在体重、进食、握力、负重游泳时间、肛温；血清和尿液激素水平；代谢水平和粪便菌群的指标。

2 生理生化指标检测

目前关于阳虚的研究主要从内分泌、免疫、血液流变学、能量代谢、自由基、微量元素等方面着手,为阳虚的深入研究提供一定的参考依据。

表1 常用肾阳虚动物模型建立方法Table 1 Method of establishment of kidney-yang deficiency animal model

2.1 阳虚与内分泌

上文中已经提到过,邝安堃通过实验研究说明阳虚与内分泌功能密切相关。 沈自尹[35]在此基础上进行了临床验证,结果表明肾阳虚患者24 h 尿17羟皮质类固醇含量普遍低于正常值,48 例肾阳虚患者中有20 例丘脑-垂体-肾上腺皮质功能异常,而30 例正常人中仅1 例。 沈自尹[35]认为肾阳虚患者存在垂体-肾上腺、甲状腺、性腺功能紊乱。 这一结论得到了很多研究者的验证。 戴冰等[36]的研究结果显示,“氢化可的松”肾阳虚模型小鼠与对照组相比,血清ACTH、血清皮质醇(Cor.)、促甲状腺激素、三碘甲腺原氨酸(T3)、甲状腺素(T4)水平降低,血清促卵泡素(FSH)、E2、T 水平升高,并认为Cor.的水平高低作为反映肾上腺皮质功能的重要指标,可用于评价肾虚模型建立的成功与否, 尤其是对于采用糖皮质激素法建立的肾虚模型。 杨宏杰等[37]和凌昌全等[38]的研究均认为,阳虚患者肾上腺皮质功能低下是由于糖皮质激素受体数量或活性的下降。刘旭光等[39]通过比较正常和“氢化可的松”阳虚大鼠血中ACTH 与Cor.含量的昼夜变动情况,发现正常大鼠血中ACTH、Cor.均有明显昼夜节律变化,而阳虚大鼠此昼夜节律变化消失,且振幅、中值减小。

以上研究以从现象到原因、从静态到动态的角度说明了阳虚患者内分泌功能低下。

2.2 阳虚与免疫系统

脾阳虚时免疫功能低下可体现在免疫细胞因子的变化,韦祎等[15]在比较通过BAT 切除术及术后给予高脂饲料建立的脾阳虚动物模型组与对照组免疫功能的研究中,发现模型组胸腺指数,脾指数,白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)均显著降低,表明模型组大鼠免疫功能低下。

2.3 阳虚与血液流变学

阳虚证可由气虚发展而来,故有“气虚者阳虚之渐,阳虚者气虚之甚”的说法。 气能生血,又能行血,气虚不仅能引起血液虚少,虚者无不滞者,还能因为气虚推动乏力导致血瘀,“阳虚则寒”,寒则气血凝滞,血流缓慢,是造成血液流变异常的主要原因。 李学玉等[40]的研究表明,阳虚患者全血粘度、血浆粘度、红细胞压积、纤维蛋白原明显高于对照组。 也有研究表明,阴虚、阳虚都存在血液流变学的异常。 刘素蓉等[41]的研究对比了阴虚、阳虚、正常人血流变学方面的差异,实验结果显示阴虚、阳虚两证与正常人相比均有血液粘度增高,红细胞电泳时间延长,血小板聚集率高的表现,说明两证均表现出血液在血管内失去了“如水之流”的生理状态,形成血瘀。

2.4 阳虚与能量代谢

阳虚与机体能量代谢关系密切,阳虚的症状表现与基础代谢率低、能量代谢水平下降、产热不足的表现相似。 唐汉庆[42]的研究探讨了BAT 切除术、(高脂饮食)和隔日寒冷环境刺激制备的脾阳虚大鼠与正常大鼠能量代谢的差异,实验表明,脾阳虚证大鼠能量代谢水平下降,血糖和甘油三酯减少,三磷酸腺苷减少,体温下降。

Na+-K+-ATP 酶在人体正常代谢中具有非常重要的作用,是存在于细胞膜上的一种特殊蛋白质,通过分解ATP 维持细胞内外液的渗透压,酶活性升高,ATP 消耗也增加,体内能量消耗和产热也增强,反之则越低[43]。 滕培颍等[7]对比了“氢化可的松”阳虚动物模型与正常动物多个脏器组织能量代谢水平,结果表明模型组肝、心、肾、小肠组织的Na+-K+-ATP 酶活性均较正常组显著降低,表明阳虚动物模型以上组织的能量代谢水平均降低。

2.5 阳虚与自由基

SOD 是存在于生物体内的一种抗氧化金属酶,可延缓由于过量的自由基对细胞结构和功能产生的损害,修复受损细胞。 何晓红等[44]观察“氢化可的松”大鼠模型组与对照组氧化相关指标含量的变化,结果表明,模型组红细胞SOD 及血浆中谷胱甘肽过氧化物酶明显低于对照组,而组织中的单胺氧化酶与过氧化脂质(LPO)高于对照组。 王钰霞等[45]在观察“氢化可的松”阳虚小鼠自由基代谢情况的研究中发现,阳虚小鼠血中SOD 活力下降,丙二醛(MDA)含量升高。 以上研究表明机体在阳虚时自由基产生与清除失衡,过剩的自由基引起细胞膜的脂类过氧化,膜脂过氧化的产物如LPO、MDA等明显升高,导致组织细胞损伤。

2.6 阳虚与微量元素

锌、镁、铜等微量元素对于机体很多酶活性的发挥具有重要作用,锌是核酸蛋白合成所必需的微量元素[46],阳虚症状与微量元素的代谢紊乱具有相关性。

吴瑞艳等[47]研究表明,30～60 岁肾阳虚伴夜尿频多、尿急、尿失禁等排尿异常的患者体中的锌、镁、铜含量水平较正常人偏低,且补充锌、镁、铜后可改善患者排尿异常的症状。 马威等[48]对比了使用右归丸治疗“羟基脲”肾阳虚动物模型前后家兔血中微量元素的代谢情况,发现家兔模型全血铜、锌、铁含量与造模前相比显著降低,治疗后全血铜、锌、铁元素含量比治疗前显著升高,表明右归丸可以使“羟基脲”肾阳虚动物模型微量元素的含量恢复正常水平。 以上研究说明,阳虚患者存在锌、铜、铁、镁等微量元素代谢紊乱。

3 分子生物学指标

从整体角度探析生物体内的动态变化的组学技术有蛋白组学、代谢组学、基因组学,与中医理论体系的“整体观”“动态关”相似,更深入地探讨阳虚证候的本质。

梁华等[6]的研究以“自然衰老”的雄性小鼠为肾阳虚研究对象,比较与青年小鼠的相关差异蛋白的表达,并对比金匮肾气丸给药前后差异蛋白的表达,结果显示青年组与肾阳虚组、肾阳虚组与给药组分别鉴定出995、674 个差异蛋白,79 个差异蛋白在金匮肾气丸给药后回调,研究表明金匮肾气丸可调整阳虚证相关的多个代谢通路中差异蛋白的变化,这些差异蛋白主要参与破骨细胞分化、糖脂代谢、细胞凋亡与自噬、氧化还原等生物功能,可初步推测肾阳虚证物质基础与此相关。 詹正烜等[49]的研究对比“甲状腺片混悬液”肾阴虚、“氢化可的松”肾阳虚模型大鼠股骨皮质骨差异蛋白的表达,结果表明,两证蛋白表达趋势相反的是CollaⅠ,肾阳虚组中主要与能量代谢有关的Ltk、Pkm2、Atp5a 等蛋白表达下调,这可能是不同肾虚状态骨量下降程度差异的原因之一。

罗向霞等[50]研究发现,代谢组指纹图谱的差异性在糖尿病视网膜病变(DR)阳虚患者与正常组之间显现,有机酸类和氨基酸类为两者潜在生物标记物,推断阳虚型DR 病情进展与机体能量代谢相关。大量证据表明肾阳虚证与肠道菌群代谢紊乱有关,Chen 等[51]的研究通过采用粪便代谢组学结合16SrRNA 基因测序,分析正常组与“氢化可的松”肾阳虚组肠道菌群的差异,结果显示,肾阳虚证与三种肠道菌群和十一种相关代谢产物有关,这些代谢产物会介导代谢紊乱如氨基酸代谢、能量代谢、甲胺代谢、胆汁酸代谢和尿素循环、短链脂肪酸代谢、神经、内分泌、免疫和消化系统、脂质代谢和碳水化合物代谢。

葛继荣等[52]研究绝经后骨质疏松症肾阳虚证患者的基因表达谱,实验结果表明,与细胞信号转导 有 关 的 基 因TRPC6、PRKG1、SDPR、CNKSR、DOK6,与免疫功能有关的基因JAM3、TAL1、HPGD、Il5ra,与钙离子活性有关的基因SLC24A3、ABLIM3、LTBP1、PCSK6, 与神经内分泌有关的基因SERPINE2、PTPRN,这些基因均呈下调趋势。 李震等[3]对比了“劳倦过度、房室不节”型肾阳虚小鼠模型与对照组的差异表达基因,结果显示,差异表达基因主要与生长激素、泌乳素、促性腺激素、炎症/免疫、促细胞凋亡以及影响多巴胺生成的限速酶、影响凝血纤溶机制和精子发育代谢的相关基因有关。

4 问题与展望

目前,学者们已经从动物模型、生理生化指标检测、分子生物学指标检测等多方面对阳虚开展了大量研究,取得了很多进展。

关于阳虚动物模型的研究通过多方面、多手段、多技术不断发展,比较常用的是糖皮质激素造模法,但此法多偏重肾阳虚,且有些文献存在不同脏腑阳虚症状相互混淆的现象,用同一种药物或造模方式建立的阳虚模型所属脏腑却不同,且外观和行为表现并没有客观量化的检测方法,判断方法较为主观。 目前对于阳虚模型建立是否成功,尚没有规范的统一判断标准,验证模型是否成功主要从以下三个方面入手：外观及行为表现；实验室指标；药物反证。 且由于证在疾病过程中是逐步演变的,甚至会从单一的证型向复合证型演变,因此, 阳虚造模要密切观察时间、剂量可能引起的证的变化,以及造模成功比较明确的剂量和时间,根据不同的实验目的选择接近实验要求的动物模型进行研究。

不管哪种造模方式都只是在某个方面模拟阳虚临床证候,并不能与临床阳虚症状全部吻合。 关于阳虚本质及物质基础的研究虽然包括很多指标,不同的方面,但特异性不高,且多为实验研究,与临床的诊断与治疗仍存在距离。 因此,未来的研究需要更多的关注临床与基础的结合,以临床为切入点,进行大量关于阳虚患者具有特异性的检测指标,将阳虚这一基础证型通过脏腑辨证更细化和全面,完善和规范不同脏腑阳虚证的诊断标准,更有利于动物模型制作方法的统一,也更有利于对阳虚本质的深入理解,为更具体的辨证论治及临床治疗提供相应的依据和参考价值。