CO2和乙酸钠对雨生红球藻生长及其虾青素积累的影响

叶 鑫 虞新磊 胡朝阳 徐年军 孙 雪

(宁波大学海洋学院/浙江省海洋生物工程重点实验室，浙江宁波 315211)

强抗氧化剂虾青素(3， 3′-二羟基-4， 4′-二酮基-β， β′-胡萝卜素)主要存在于甲壳动物、藻类和微生物中，具有抵御紫外线伤害、提高免疫力、抑制肿瘤生长等作用[1]。雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)是虾青素的优质天然来源，其积累虾青素量最高可达细胞干重的 4．6%[2]。雨生红球藻是绿藻纲(Chlorophyceae)红球藻科(Haematococcaceae)的一种单细胞微藻，在低光、营养充足的环境中藻细胞呈绿色游动状态，生长分裂迅速；在高光、高盐、低氮等不利环境下藻细胞鞭毛消失、细胞壁增厚并静止不动开始积累虾青素[3-4]。因此，目前利用雨生红球藻生产虾青素一般分两个阶段：首先在适宜的培养条件下促进绿色营养阶段藻的生物量积累，然后利用高光强等因素诱导厚壁孢子阶段藻细胞的虾青素积累。在这两个阶段碳源对藻的生长和虾青素积累都起着重要的作用。

CO2和碳酸氢盐是雨生红球藻培养中常用的无机碳源。与有机碳源相比，无机碳源可显著降低培养基被微生物污染的风险。研究表明，适当提高CO2浓度不仅可以促进雨生红球藻的生长[5]，还可刺激藻细胞脂质积累和虾青素的合成[6-7]。与乙酸盐相比较，碳酸氢盐可诱导雨生红球藻细胞产生更多的虾青素，且持续补充5% CO2后雨生红球藻虾青素合成速率与含量更高，最大分别可达6．25 mg.L-1.d-1和175．7 mg.L-1[8]。除无机碳源外，雨生红球藻也可以利用乙醇、乙酸盐、甘油、葡萄糖等常见有机碳源进行兼养生长[9-12]。其中，乙酸盐是雨生红球藻培养中常用的廉价有机碳源。乙酸盐可增强雨生红球藻的呼吸作用，减少虾青素积累时期高光胁迫对藻细胞的损伤，促进藻的生长和虾青素的积累[13]，但乙酸盐培养雨生红球藻存在容易污染微生物、藻细胞活力低等问题[14]。研究表明，在雨生红球藻培养过程中补充C5 有机碳可以极大地提高藻的生物量，改善藻细胞活力，且能减少污染[15]。

综上，无机碳源和有机碳源在促进雨生红球藻生长和虾青素积累方面发挥了重要的作用。本研究选用4 倍空气CO2浓度(0．16% CO2)和响应面法优化所得的乙酸钠浓度(0．023 mol.L-1)，比较了这2 种碳源对雨生红球藻生长、虾青素含量、酶活性和基因表达等参数的影响，以期为高效培养雨生红球藻、提高虾青素产量提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料与分组试验

雨生红球藻藻株489，由宁波大学海洋生物工程重点实验室藻种库提供，基础培养基为NBM3#培养基[16]。绿色营养阶段培养条件：温度为25±0．5℃，光通量为40 μmol.m-2.s-1，光暗周期比为12 h ∶12 h，初始接种密度约为4×104个.mL-1。厚壁孢子培养：将生长到平台期的绿色营养阶段藻4 000 r.min-1离心5 min，收集藻细胞接入到等体积新鲜培养基中进行高光胁迫(光通量150 μmol.m-2.s-1)以诱导虾青素合成，培养温度和光周期与绿色营养阶段相同。

试验共设置3 组处理：对照组(正常空气，0．04%CO2)、高CO2组(0．16% CO2)、乙酸钠组(正常空气+0．023 mol.L-1乙酸钠)。除碳源不同外，其他培养条件均相同。以上及后续试验每组均设置3 个生物学重复。

1.2 试验方法

1．2．1 细胞形态观察 分别在绿色营养阶段培养1、5、8 d 时和厚壁孢子阶段培养1、3、5、8 d 时取3 mL 藻液4 000 r.min-1离心5 min，将藻体沉淀重悬于300 μL新鲜培养基中(后期藻液密度高时进行稀释)，制片后在CX21FS1 显微镜(OLYMPUS，日本)下放大400 倍观察藻细胞形态和游动性并拍照记录。

1．2．2 细胞生长曲线测定 在绿色营养阶段培养过程中，每天定时取样，使用UV-5200 紫外可见分光光度计(上海元析仪器有限公司)测定680 nm 波长处的吸光度值(OD680)，根据OD680(x)与细胞密度(y)关系曲线y＝8．326 2x+0．072 7(R2＝0．993 4)计算藻细胞密度。

1．2．3 干重测定 在两个阶段雨生红球藻培养的第8 天，分别于6 500 r.min-1离心(4℃)10 min 收集藻体，将藻体沉淀冷冻干燥48 h 后准确称重，然后将干藻粉保存在-80℃并用于后续试验。

1．2．4 可溶性蛋白、总脂、总糖含量测定 分别称取培养第8 天两个阶段的干藻粉各0．1 g(干重，DW)，在液氮中充分研磨后，加入4 mL pH 值7．4 的磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)，涡旋混合均匀后于6 500 r.min-1(4℃) 离心10 min，保留上清液。利用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量法测定可溶性蛋白含量[17]；利用香草醛法测定总脂含量[18]；使用总糖含量测试盒(苏州科铭生物技术有限公司)测定总糖含量。

1．2．5 虾青素含量测定 参考崔丹丹等[19]的方法。准确称取0．01 g 厚壁孢子阶段(第8 天)的干藻粉，加入10 mL 5% KOH+30%甲醇，室温静置5 min；6 000 r.min-1离心(4℃)3 min 后取藻体沉淀研磨5 min，然后加入10 mL 二甲基亚砜在30℃水浴中抽提虾青素。反复抽提至藻体变白后，用UV-5200 紫外可见分光光度计测定OD490。虾青素含量计算公式为：

式中，C 为虾青素含量，mg.g-1DW；OD490为样品在490 nm 处的吸光度值；m 为样品干重。

1．2．6 基因转录表达分析 在雨生红球藻绿色营养阶段的第4 ～第6 天和厚壁孢子阶段的第1 ～第3 天，每天分别离心收集藻体，使用Trizol 试剂(Invitrogen，美国) 提取藻的总RNA。分别使用iScript cDNA Synthesis kit 和iTaq Universal SYBR Green Supermix 试剂盒(Bio-Rad，美国)进行RNA 反转录和荧光定量PCR。采用2-ΔΔCT法[20]计算基因的相对表达量。荧光定量PCR 引物采用Primer Premier 5．0 软件设计，所用基因序列来自宁波大学藻类生物资源利用团队的雨生红球藻转录组测序结果(表1)。

1．2．7 酶活力测定 取绿色营养阶段培养4、5、6 d和厚壁孢子阶段培养1、2、3 d 时的藻液，6 500 r.min-1(4℃)离心10 min，每组取0．5 g 藻体(湿重，FW)，经液氮研磨后，2 000 r.min-1(4℃)离心10 min，上清液即为粗酶液。核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)活力测定方法参考李合生[21]的分光光度法，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase， PEPC) 和苹果酸脱氢酶( malate dehydrogenase，MDH)活力测定均使用苏州科铭生物有限公司的试剂盒。

表1 荧光定量PCR 的引物信息Table 1 Primer information for real-time quantitative PCR

1.3 数据统计与分析

所有数据均用平均值±标准差(mean±SD，n＝3)表示。数据分析和作图使用Microsoft Office Excel 2017，并采用软件SPSS 22．0 的单因素方差(one-way ANOVA)分析数据之间差异显著性，P＜0．05 表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 碳源对绿色营养阶段雨生红球藻细胞状态和生长的影响

在绿色营养阶段，不同碳源对雨生红球藻细胞状态的影响较明显(图1)。培养前4 天时，3 组藻细胞都呈游动状态，细胞活力较好。对照组雨生红球藻从培养第7 天开始细胞活力减弱，少数藻的细胞壁开始变厚；高CO2组在培养第8 天时雨生红球藻细胞活力仍然较好，呈游动细胞状态；乙酸钠组在培养第5 天时大约有10%～20%的藻细胞壁增厚变成厚壁孢子，培养第8 天时约有70%～80%的细胞静止不动，约30%～40%藻细胞开始积累虾青素。

由图2 可知，补充CO2和乙酸钠对雨生红球藻生长的促进作用明显。培养1 d 时，藻细胞处于延滞期，细胞分裂缓慢；培养2 ～6 d 时，高CO2和乙酸钠组藻细胞生长速度超过了对照组，但两组之间无显著差异；培养7～8 d 时，高CO2组藻细胞密度显著高于乙酸钠组。培养第8 天时，高CO2、乙酸钠组藻细胞密度分别为对照组的2．55、2．23 倍(图2)，干重分别为对照组的1．81、1．56 倍(表2)。综上，提高CO2浓度或补充乙酸钠都可显著促进雨生红球藻的快速生长，且在培养后期CO2的促进作用大于乙酸钠。

2.2 碳源对绿色营养阶段雨生红球藻生理生化参数的影响

雨生红球藻的生理生化参数受CO2浓度和乙酸钠的影响(表2)。高CO2组和乙酸钠组藻的可溶性蛋白含量显著高于对照组，分别为对照组的1．89 和1．23 倍(P＜0．05)；高CO2组和乙酸钠组藻的总糖含量分别是对 照 组的0．77(P＜0．05)、1．09 倍(P＞0．05)；高CO2组和乙酸钠组藻的总脂含量分别为对照组的0．65 和1．26 倍(P＜0．05)。以上结果表明，CO2促进了绿色营养阶段雨生红球藻蛋白质的合成，抑制了其碳水化合物和脂类合成，而乙酸钠则促进了藻细胞蛋白质和脂类的积累。

2.3 碳源对绿色营养阶段雨生红球藻生长相关基因表达及酶活力的影响

雨生红球藻中Rubisco 大亚基、PEPC 和MDH 的编码基因——rbcL、pepc2、mdh的转录表达对外源添加碳源的响应不同(图3)。培养4 ～6 d，高CO2组中rbcL转录表达较稳定且与对照组无显著差异，而乙酸钠组藻rbcL 表达量在培养第5 和第6 d 时分别下降至对照组的57%和39%。在培养4～6 d 时，pepc2 和mdh表达量在2 种碳源添加组中均较对照组升高，但两组间基本无显著差异(pepc2 在培养第6 天时除外)。

CO2或乙酸钠均显著影响雨生红球藻中Rubisco、PEPC 和MDH 活力(图4)。培养过程中高CO2组藻细胞Rubisco 活力较为稳定，且在培养第5 和第6 天时显著高于其他两组，表明适当提高CO2浓度可以增强Rubisco 活力；乙酸钠组中Rubisco 活力在培养前期与对照组无显著差异，在培养第6 天时较对照组显著下降。PEPC 和MDH 对高CO2和乙酸钠的响应相似，培养4～6 d 时较对照组均升高，在第6 天时，高CO2和乙酸钠组藻的PEPC 活力分别升高至对照组的1．98和1．45 倍，MDH 活力则分别升高至对照组的2．38 和2．01 倍。培养第6 天时，乙酸钠组的2 种酶活力均低于高CO2组。以上结果表明，2 种碳源都可通过显著提高PEPC、MDH 的活力来加速柠檬酸循环，为藻细胞生长提供充足能量。

2.4 碳源对厚壁孢子阶段雨生红球藻细胞形态的影响

由图5 可知，2 种碳源对厚壁孢子阶段藻细胞的影响不同。对照组在高光胁迫第1 天，细胞活力降低并少量积累虾青素，但大部分细胞仍呈游动状态；从胁迫第3 天开始部分细胞转为厚壁孢子，并有少量细胞溶解；胁迫第8 天时，大部分藻细胞积累虾青素变红，但仍有部分藻细胞为绿色。高CO2组中，高光胁迫第1 天，藻细胞活力好，游动速度快；胁迫第3 天时，少量藻细胞开始积累虾青素；胁迫第5 天时大量细胞转化为厚壁孢子同时细胞颜色变红；胁迫第8 天时，藻细胞中已积累较多虾青素，但藻细胞状态较好，基本无细胞溶解。乙酸钠组中，高光胁迫后虾青素快速积累，在胁迫第1 天时90%以上的藻细胞已变成厚壁孢子；胁迫3～8 d 时，细胞内红色区域不断扩大，表明虾青素持续积累，但从胁迫第5 天开始有少数藻细胞开始溶解，且溶解细胞数随着胁迫时间延长而增多。

图2 绿色营养阶段雨生红球藻的生长曲线Fig.2 The growth curve of H. pluvialis at green vegetative stage

表2 绿色营养阶段雨生红球藻生理生化参数Table 2 Physiological and biochemical parameter of H. pluvialis at green vegetative stage

图3 绿色营养阶段雨生红球藻生长相关酶的转录水平变化Fig.3 Expression levels of the growth-related enzymes of H. pluvialis at green vegetative stage

2.5 碳源对厚壁孢子阶段雨生红球藻生理生化参数的影响

在厚壁孢子阶段，高CO2组和乙酸钠组雨生红球藻的生理生化参数与对照组差异显著(除总脂含量外)(表3)。在胁迫第8 天时，3 个试验组藻细胞干重分别为0．24、0．47、0．37 g.L-1。以单位体积藻液来计算，高CO2组和乙酸钠组中虾青素含量分别为2．76和2．13 mg.L-1，分别是对照组的2．40 和1．85 倍。可见补充CO2或乙酸钠后藻细胞中虾青素浓度显著提高，且高CO2组大于乙酸钠组。

厚壁孢子阶段雨生红球藻的可溶性蛋白含量由高到低表现为高CO2组＞乙酸钠组＞对照组。两个处理组中藻的总糖含量均显著低于对照组，但两组间无显著差异；碳源种类对厚壁孢子阶段藻总脂含量无显著影响。

2.6 碳源对厚壁孢子阶段雨生红球藻基因表达和酶活力的影响

在厚壁孢子阶段雨生红球藻中，虾青素代谢相关酶八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturase，PDS)、β-胡萝卜素羟化酶(β-carotene hydroxylase，CHY)和β-胡萝卜素酮化酶(β-carotene ketolase，BKT)的编码基因——pds、chy和bkt2 的转录表达对2 种碳源的响应类似(图6)。在胁迫1 ～2 d 时，高浓度CO2总体抑制3 个虾青素合成相关基因的转录表达，而在胁迫第3天时，高CO2组中3 个虾青素合成相关基因表达量上调，与乙酸钠组无显著差异。与高CO2组不同，乙酸钠组显著促进了3 个虾青素合成相关基因的表达。胁迫第1 天时，高CO2组pds、chy、bkt2 基因表达水平约为对照组的31%、41%和42%，而乙酸钠组3 个基因表达量分别为对照组的3．11、2．94 和4．18 倍。

图5 厚壁孢子阶段雨生红球藻细胞形态Fig.5 Cell morphology of H. pluvialis at red cyst stage

在厚壁孢子阶段，雨生红球藻Rubisco 活力对CO2或乙酸钠的响应不同(图7)。在对照组与高CO2组中，Rubisco 活力随着高光胁迫时间延长逐渐上升，而乙酸钠组Rubisco 活力在胁迫1 ～3 d 内无明显变化。胁迫1～3 d 时，与对照组相比，高CO2组促进了雨生红球藻Rubisco 活力的升高，而乙酸钠则主要抑制了Rubisco 活力。在高光胁迫第3 天时，高CO2组和乙酸钠组Rubisco 活力分别为对照组的1．41 和0．50 倍(P＜0．05)。雨生红球藻中PEPC、MDH 活力在两个处理组中的变化类似，活力均较对照组提高。

表3 厚壁孢子阶段雨生红球藻生理生化参数和虾青素含量Table 3 Physiological and biochemical parameter and astaxanthin content of H. pluvialis at red cyst stage

3 讨论

3.1 CO2 和乙酸钠对雨生红球藻生长的影响

CO2是藻类生长的重要碳源，因此在微藻培养过程中适当提高环境CO2浓度，可以促进藻细胞的光合作用，加速藻类生长。转录组测序结果表明，用15%CO2培养雨生红球藻后，其光合作用、糖酵解、碳固定途径等相关基因的表达均上调[22]。本研究结果显示，CO2浓度从0．04%提高至0．16%后，藻生长加快，其细胞密度和干重都增加，这可能与藻的光合作用、能量代谢增强有关。同时，较高的CO2浓度可以延缓藻细胞衰老，提高细胞的活力，因此在培养第8 天时藻细胞活力仍较好，细胞壁也未变厚。

乙酸盐是微藻培养中常用的有机碳源，可以使藻进行异养生长。乙酸盐进入藻细胞后在乙酰CoA 合成酶(acetyl-CoA synthetase，ACS)的催化作用下直接生成乙酰CoA，后者又可以参与到柠檬酸循环和脂质合成等代谢过程中。乙酸钠可以促进聚球藻(Synechococcus leopoliensis)生长，其主要原因是由于乙酸钠增加了柠檬酸循环中的碳代谢流量[23]。本研究添加乙酸钠后雨生红球藻生长加快，但在培养后期，藻的生长速度和生物量均低于高CO2组，这可能与后期乙酸钠组游动藻细胞数量减少，部分藻细胞壁逐渐变厚并开始积累虾青素有关。Pang 等[15]发现添加乙酸钠会导致雨生红球藻游动性变差，培养至第7 天时游动细胞数量只占总细胞数的7%，本研究结果与之相似。

图7 厚壁孢子阶段雨生红球藻生长相关酶活力Fig.7 Activities of growth-related enzymes of H. pluvialis at red cyst stage

Rubisco 作为光合作用的关键酶之一，在植物细胞中主要起固定CO2的作用。加富1 000 ～1 500 μmol.L-1CO2可提高Rubisco 和Rubisco 活化酶的活力，从而提高黄瓜叶片净光合速率[24]。CO2浓度升高可促进拟柱胞藻(Cylindrospermopsis raciborskii)光捕获效率和光合作用能量转换效率，使Rubisco 活力增强[25]。本研究中高浓度CO2促进了雨生红球藻Rubisco 活力升高，提高了细胞固碳和光合效率，从而加速了藻的生长。乙酸钠会抑制雨生红球藻Rubisco活力和Rubisco 编码基因的表达[26]，本研究中乙酸钠组藻细胞Rubisco 活力及rbcL表达水平在培养后期均下降，该结果与以上报道一致。PEPC、MDH 在植物细胞内均可以催化草酰乙酸的生成，而草酰乙酸是柠檬酸循环中的一个重要中间产物。本研究中，CO2或乙酸钠均提高了雨生红球藻中PEPC、MDH 活力及其相关编码基因的转录表达，CO2比乙酸钠提高效果更明显。可见， CO2浓度升高可以促进雨生红球藻Rubisco、PEPC 和MDH 活力增强，加快光合作用和柠檬酸循环，从而促进藻生物量的积累；而乙酸钠则主要通过加速柠檬酸循环为细胞代谢提供更多能量，从而促进藻的生长。

无论在高光还是低光培养条件下，2 种碳源处理组雨生红球藻Rubisco 活力变化趋势基本一致，即高CO2浓度增强Rubisco 活力，乙酸钠则抑制其活力。曾晓鹏等[27]发现160 μmol.m-2.s-1光强培养下，高CO2浓度可显著增强三角褐指藻Rubisco 活力，使得藻细胞的净光合效率得到提高。Zhang 等[13]发现添加乙酸钠后，雨生红球藻叶绿素荧光参数和光合速率下降，光合作用减弱，该结果与本研究中乙酸钠对Rubisco 活力的影响类似。在绿色营养和厚壁孢子阶段，雨生红球藻中PEPC 和MDH 活力均受高浓度CO2或乙酸钠的诱导，但诱导程度不同。

3.2 CO2 和乙酸钠对雨生红球藻虾青素积累的影响

本研究中，乙酸钠的添加对雨生红球藻虾青素合成有较大的影响。在绿色营养阶段后期，乙酸钠组中约30%～40%的雨生红球藻细胞开始合成虾青素；高光胁迫开始后藻细胞中虾青素合成更加快速，在胁迫第1 天藻细胞即快速变红。在高光胁迫条件下，乙酸钠促进雨生红球藻合成虾青素可能与乙酸钠可增强细胞呼吸速率，为虾青素合成提供充足碳骨架、提高藻细胞自身光保护作用有关[13]。

PDS、CHY、BKT 是参与虾青素合成的关键酶。本研究高CO2组中，这3 种酶的编码基因表达量在胁迫1～2 d 时降低或无明显差异，在胁迫第3 天时上升；而乙酸钠组中，3 个相关基因在胁迫第1 天就开始快速大量表达，说明乙酸钠促进虾青素积累的速度比高CO2要快，而且这3 个虾青素代谢相关酶的转录水平变化与高CO2组藻细胞变红速度慢于乙酸钠组的现象一致。Cheng 等[9]利用2%～10%CO2诱导雨生红球藻积累虾青素，0 ～5 d 时所有试验组虾青素积累量均较低，而从第5 天开始虾青素快速合成，这一现象与本研究类似。另外，Gao 等[28]研究表明，乙酸钠在第0．5或第2 天能快速促进雨生红球藻虾青素合成相关酶编码基因的表达，如八氢番茄红素合酶基因(phytoene synthase，psy)、番茄红素β-环化酶基因(lycopene beta cyclase，lyc)以及bkt基因。

4 结论

在绿色营养阶段，2 种碳源均可以加快藻的生长、可溶性蛋白的合成，增强PEPC、MDH 活力及其基因转录表达。在厚壁孢子阶段，2 种碳源均可以提高藻的生物量、虾青素产量、3 个虾青素合成相关酶的转录水平以及PEPC 和MDH 活力。综上，适当补充CO2或乙酸钠均可促进雨生红球藻生物量和虾青素的积累，但高CO2浓度培养的藻细胞状态好，乙酸钠则在促进虾青素的快速积累方面表现出一定优势。本研究在一定程度上阐明了这2 种碳源促进雨生红球藻生长和虾青素积累的机理，为开展雨生红球藻虾青素的高效生产提供了参考。