血清miR⁃135、miR⁃601、CA72⁃4及CA19⁃9的表达水平与胃癌诊断的相关性

杜记涛 曹建 赵稳 万相斌 李智

胃癌（gastric carcinoma，GC）是临床常见的一种消化系统的恶性肿瘤，其最先发生于机体胃黏膜上皮细胞，好发于中老年群体中，且男性发病率明显高于女性［1］。据相关调查研究显示，目前全球范围内GC 的发病率和死亡率已分别跃居恶性肿瘤的第5 位和第3 位，而我国GC 发病率、死亡率分别位于全部恶性肿瘤第2 位，第3 位，远远高于世界的平均水平［2］。大部分GC 患者在早期无明显临床症状，仅有少数患者表现为消化不良、饱胀不适等非特异性症状，因此很容易被忽略，进而使患者错过最佳治疗时机。目前临床多通过组织活检和胃镜对GC 患者进行诊断，但其侵入性较强，因此还需寻找其他高效安全的诊断方法。研究表明，miR⁃135、miR⁃601在癌症的发生发展中发挥着重要的作用［3⁃4］；由于肿瘤标志物具有检测快速、简单、创伤小等优势被临床广泛应用肿瘤的诊断中，而糖类抗原72⁃4（cancen anti⁃gen 72⁃4，CA72⁃4）、糖类抗原19⁃9（cancen antigen 19⁃9，CA19⁃9）是临床常见的消化系统肿瘤标志物。但目前关于其诊断GC 的研究还相对较少。因此，本研究主要是探究血清miR⁃135、miR⁃601、CA72⁃4 及CA19⁃9 的表达水平与GC 诊断的相关性，旨在为GC的临床诊治提供更多参考依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2015年1月至2020年10月就诊于本院的106例GC患者作为观察组，其中男83例，女23例；平均年龄（65.76±3.67）岁；GC类型：腺癌91例，粘液腺癌6例，印戒细胞癌4例，其他类型5例；TNM肿瘤分期：Ⅰ期46例，Ⅱ期16例，Ⅲ期30例，Ⅳ期14例；另选取同期于本院进行健康体检的健康人群45例作为对照组，平均年龄（66.02±3.54）岁；两组在性别、年龄的比较中差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

纳入标准：①参照《胃癌规范化诊疗指南（试行）》［5］中GC 的诊断标准，所有患者均确诊为GC；②未接受过相关治疗的患者；③临床依从性较高的受试者；④患者或其家属签订知情同意书。排除标准：①合并其他肿瘤疾病的受试者；②合并胃肠道及肝胆疾病的患者；③中途退出的受试者；④临床资料不完整的受试者。

1.2 方法

1.2.1 样品的制备

在受试者被纳入研究后的第2 天清晨抽取其空腹肘静脉血6 mL，置于EP 管内，在常温下静置1 h后，采用离心法分离出血清，将等分为两份置于干燥试管内，于-25℃保存待测。

1.2.2 血清miR⁃135、miR⁃601 水平的检测

取其中一份待测样品，采用总RNA 抽提试剂（TRIzol 试剂，上海杰美基因医药科技有限公司）对将其总RNA 分离，采用实时定量聚合酶链式反应（quantitative real⁃time polymerase chain reaction，qRT⁃PCR）对miR⁃135、miR⁃601 的表达进行检测。其中miR⁃135 的上游引物是：5′⁃ATGTACGCTACT⁃GTGAGCTG⁃3′，下游引物是5′⁃GTCAGCGAGT⁃GAGCATAG⁃3′；miR⁃601 的上游引物是5′⁃GAT⁃GACTGTATGACTCTCAG⁃3′，下游引物是5′⁃AGT⁃GTACTACATAGTACG⁃3′。反应的体系共20 μL，分为10 μL TaqMan 2×Universal PCR Master Mix、1 μL TaqMan MicroRNA Assay、1.33 μL cDNA、7.67 μL ddH2O，充分混合。扩增的条件是10 min 95℃预变性、15 s 95℃变性、60 s 60℃复性，内参照为U6，共循环45 次，实验开展3 次。所用仪器由美国ABI 公司提供，试剂盒由新海基因检测有限公司提供。计算方法为：用2⁃△△Ct法（△Ct=Ct目的基因⁃CtU6）。

1.2.3 血清CA72⁃4、CA19⁃9 水平的检测

取另一份待测样品，采用电化学发光法对血清CA72⁃4、CA19⁃9 水平进行检测，所用试剂盒由上海罗氏制药有限公司提供。

1.3 观察指标

①比较两组血清miR⁃135、miR⁃601、CA72⁃4及CA19⁃9 的表达水平；②采用Pearson 相关系数分析血清miR⁃135、miR⁃601、CA72⁃4 及CA19⁃9 水平与GC 发生的相关性；③采用受试者工作特征（receiver operator characteristic，ROC）曲线评价血清miR⁃135、miR⁃601、CA72⁃4 及CA19⁃9 对GC 的诊断效能。

1.4 统计学方法

采用SPSS 18.0 进行统计学分析，符合正态分布，计量资料采用（）进行表示，采用t检验；计数资料采用例n（%）进行表示，采用χ2检验；P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血清miR⁃135、miR⁃601、CA72⁃4及CA19⁃9表达水平的比较

观察组血清miR⁃135、miR⁃601、CA72⁃4 及CA19⁃9 表达水平均显著高于对照组，差异均具有统计学意义（t1=7.018，t2=7.523，P＜0.05）。见图1。

图1 两组血清miR⁃135、miR⁃601 表达水平的比较Figure 1 Comparison of serum miR⁃135 and miR⁃601 expression levels between 2 groups

2.2 血清miR⁃135、miR⁃601、CA72⁃4 及CA19⁃9 水平与GC 发生的相关性分析

根据Pearson 相关分析结果可知，血清miR⁃135、miR⁃601、CA72⁃4 及CA19⁃9 与GC 的发生呈正相关，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 血清miR⁃135、miR⁃601、CA72⁃4 及CA19⁃9 水平与GC 发生的相关性分析Table 1 Analysis of the correlation between serum miR⁃135，miR⁃601，CA72⁃4 and CA19⁃9 levels and the occurrence of GC

2.3 血清miR⁃135、miR⁃601、CA72⁃4 及CA19⁃9 对GC 诊断效能的评价

血清miR⁃135、miR⁃601、CA72⁃4 及CA19⁃9 均可有效诊断GC，联合诊断的灵敏度、特异性、准确度，阳性预测值、阴性预测值、ROC 曲线下面积（area under curve，AUC）均显著高于单一指标诊断的值，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。见图2、表2。

图2 血清miR⁃135、miR⁃601、CA72⁃4、CA19⁃9 及其联合检测对GC 诊断的ROC 曲线Figure 2 ROC curve of serum miR⁃135，miR⁃601，CA72⁃4，CA19⁃9 and their combined detection for GC diagnosis

3 讨论

GC 作为世界范围内的恶性肿瘤，全球每年新发确诊病例达到了95 万例，死亡病例达到了72 万例，对人类的身体健康及生命安全造成了严重的威胁［6］。由于GC 患者早期临床症状并不显著，导致大多数患者在确诊时一般已至肿瘤的中晚期了，而早发现、诊断、治疗是提高GC 患者生存质量的主要方法之一，因此一种高效的早期诊断方法被临床迫切需要。目前临床主要通过形态学对GC患者进行诊断，活检病理诊断是其金标准，但由于其属于侵入性检查，患者耐受程度较低且不适于反复检查。miRNA 是由肿瘤细胞主动分泌的一种小分子，其表达水平能够随着肿瘤的生成与凋零发生显著性的变化，对临床多种恶性肿瘤的早期诊断、治疗以及预后都有着重要的指导意义。

表2 血清miR⁃135、miR⁃601、CA72⁃4 及CA19⁃9 对GC 诊断效能的评价Table 2 Evaluation of serum miR⁃135，miR⁃601，CA72⁃4 and CA19⁃9 for diagnosis of gastric cancer

Yin 等［7］研究结果显示，GC 患者血清miR⁃135、CA19⁃9 水平明显高于健康人群；Min 等［8］研究显示，与癌旁正常组织相比，GC 组织miR⁃601 明显上调；韩莹波等［9］学者发现，GC 患者血清CA72⁃4、CA19⁃9 的表达水平高于正常人群；在本研究结果与上述研究结果完全相符，表明GC 患者血清miR⁃135、miR⁃601、CA72⁃4 及CA19⁃9 的表达水平显著上调。miRNA 在真核生物中广泛存在，是基因调控机体网络的重要组成成分之一，通常是通过调节机体细胞基因的表达影响机体各项病理生理过程［10］，目前已有研究结果显示，miR⁃135、miR⁃601 在多种癌症高表达［11⁃12］；CA72⁃4 是高分子量的一种粘蛋白，由单克隆抗体B72.3 和CC 49 确定，在健康机体内，其含量一般较低，但在多种肿瘤组织中呈高表达［13］；CA19⁃9 作为E⁃选择素（E⁃selectin）配体，是一种糖类抗原，是上皮的源性肿瘤广谱的标志物，在血管的内皮细胞与肿瘤细胞间的黏附中发挥着重要的作用，被临床广泛用于胃癌的诊断、病情评估以及预后推测中［14］。综合上述提示，miR⁃135、miR⁃601、CA72⁃4 及CA19⁃9 可作为GC 诊断的重要临床指标，进而为临床治疗提供指导。

于伟等［15］研究结果显示，GC 患者血清CA72⁃4、CA19⁃9 水平高于胃良性疾病患者和健康人群，而胃良性疾病患者有明显高于健康人群。与上述研究结果基本相符，同时还发现，血清miR⁃135、miR⁃601 水平与GC 的发生也呈正相关，上述研究结果表明，可根据机体血清miR⁃135、miR⁃601、CA72⁃4 及CA19⁃9水平的变化情况对GC 进行早期诊断。

肿瘤标志物是非侵入性的、简单的一种临床诊断方法，被广泛用于肿瘤的早期诊断、疗效判断以及预后评估中，并取得了较为显著的效果，但临床多项研究表明，单一肿瘤标志物特异性、敏感性以及准确性较低，限制了其临床应用［16⁃17］；本研究结果显示，血清miR⁃135、miR⁃601诊断GC的效能较高，但仍存在一定的不足之处，为进一步提高GC 的早期诊断效能，于是本研究将血清miR⁃135、miR⁃601与肿瘤标志物CA72⁃4、CA19⁃9 进行联合，结果发现其诊断GC的特异性、灵敏度、准确度以及AUC 等均明显升高，结果表明，单一指标检测的值难免会具有一定的局限性，而联合检测则在一定程度上弥补了单一指标所检测的不足，因此，提示可联合血清miR⁃135、miR⁃601、CA72⁃4 及CA19⁃9 共同诊断GC。

综上所述，血清miR⁃135、miR⁃601、CA72⁃4 及CA19⁃9 的表达水平在GC 患者中显著上调，与GC的发生呈正相关，且四个指标联合诊断GC 的灵敏度、特异性以及准确度更高，对临床早期诊断GC有着较高的参考价值。