沙棘黄酮对辐射损伤小鼠造血系统的保护作用及其机制

卫守喆,刘 伟,杨宏昕

(内蒙古自治区人民医院药学处临床药学科,呼和浩特 010017;*通讯作者,E-mail:ny1882@163.com)

沙棘是我国蒙药传统药材,沙棘黄酮是沙棘中提取的含有多种黄酮成分的一组化合物。经药理学研究证实沙棘黄酮具有抗氧化作用,能够清除体内过多自由基,从而降低自由基损伤产生的不良效应[1]。目前在治疗循环、免疫、神经和内分泌等系统疾病方面有广泛的应用[2]。现阶段放射性治疗是治疗恶性肿瘤的常用方法,但在治疗过程中常由于辐射损伤会产生一系列不良反应。有研究报道辐射损伤产生主要由于电离辐射后导致自由基损伤,从而导致机体器官损伤[3]。而且现阶段应用的的抗辐射药物普遍存在治疗窗较窄、不良反应多及选择性不高等问题[4]。因此,亟待开发高效、低毒、临床使用方便的抗辐射药物。因而,本实验拟采用直线加速器对小鼠进行单次全身照射,观察沙棘黄酮对辐射损伤后小鼠造血调控因子的调节作用,并观察骨髓单个核细胞(bone marrow mononuclear cells,BMNCs)细胞周期和凋亡率变化,进而探讨沙棘黄酮抗辐射损伤机制,为辐射防护剂新药研发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验药物 沙棘黄酮胶囊,内蒙古宇航人公司,批号160301,临用前取沙棘黄酮胶囊内容物以1%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)配成制备成浓度10 mg/ml的混悬液,现配现用。

1.1.2 实验动物 健康无特定病原体(SPF级)BALB/c小鼠60只,12-16周龄,体质量18-22 g,购自内蒙古大学实验动物中心,合格证号:20150001。

1.1.3 实验主要仪器及试剂 血清粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、血小板生成素(TPO)、白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子(TNF-α)ELISA检测试剂盒购自齐一生物科技(上海)有限公司;Annexin Ⅴ-FITC/PI检测试剂盒、凋亡试剂盒购自上海吉凯基因化学技术有限公司;2300C/D SN416型直线加速器治疗机(美国Varian公司);FACS Calibur流式细胞仪(美国BD公司)。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组及给药方法 实验小鼠随机分为3组:空白对照组、放射对照组和给药组,每组20只,雌雄各半。空白对照组:假照射,仅灌胃给予等量1%羧甲基纤维素钠,连续灌胃至造模后14 d。放射对照组:照射造模当天开始灌胃给予等量1%羧甲基纤维素钠,连续灌胃至造模后14 d。给药组:照射造模当天开始灌胃给予沙棘黄酮混悬液,每日1次,给药剂量为20 ml/kg,连续灌胃至造模后14 d。

1.2.2 造模方法 除空白对照组外,取其他两组受试小鼠依次接受直线加速器单次全身照射(4.0 Gy,3.2 Gy/min,焦点距小鼠约100 cm,照射时间1.25 min)。造模后3 d摘除眼球取血检测白细胞计数,通过白细胞计数(低于4.0×109g/L)判断造模成功。空白对照组给予假照射,即不进行照射,只将受试小鼠放置在相同环境下,留置时间相同。

1.2.3 辐射损伤小鼠G-CSF、TPO、IL-1β和TNF-α含量检测 放射对照组与给药组受试小鼠分别于造模后3,14 d各取10只,摘除眼球取血后处死,所取血液室温放置1.5 h,然后放置于2-8 ℃冰箱内至血液凝固,再将样本进行离心处理,转速2 600 r/min,离心10 min,取离心后上清液保存备用。检测时按照试剂盒说明书要求测定血清中各调控因子的含量。

1.2.4 BMNCs制备 实验小鼠分别于造模成功后第3和14天脱颈处死,取股骨用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗出骨髓细胞,冲洗液离心后弃去上清液,适量PBS洗涤,形成骨髓细胞悬液。骨髓细胞悬液采用Ficoll-Hypague密度梯度离心法处理后可获取BMNC悬液。

1.2.5 BMNCs细胞周期检测 实验小鼠分别于造模后第3和14天,收集BMNCs悬液100 μl,用4 ℃的70%冰乙醇固定过夜;固定液用磷酸盐缓冲液洗涤2次,加入100 μl牛胰核糖核酸酶(1 mg/ml),置于恒温水浴箱(37 ℃)中孵育30 min;加入10 μl碘化丙啶染色液(50 μg/ml),避光反应30 min,后将染色液于流式细胞仪上检测[5]。

1.2.6 BMNCs细胞凋亡率检测 实验小鼠分别于造模后第3和14天收集BMNCs,PBS洗涤2次,用Binding缓冲溶液重悬沉淀;取细胞液100 μl,分别先后加入PI染色液和Annexin Ⅴ-FITC染色液各5 μl;混匀后室温避光孵育15 min,样品中加入Binding缓冲溶液100 μl,用双参数分析法计算出凋亡细胞及凋亡百分率[5]。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 沙棘黄酮对辐射损伤小鼠G-CSF、TPO、IL-1β水平影响

造模后3 d,与空白对照组比较,给药组和放射对照组小鼠的G-CSF、TPO、IL-1β水平均明显升高(P<0.05);与放射对照组比较,给药组G-CSF、TPO水平明显升高(P<0.05),IL-1β水平无差异。造模后14 d,与空白对照组比较,给药组和放射对照组小鼠的G-CSF、TPO、IL-1β水平均明显升高(P<0.05);与放射对照组比较,给药组G-CSF、TPO、IL-1β水平明显升高(P<0.05)。与造模后3 d比较,放射对照组小鼠的G-CSF、TPO、IL-1β水平均明显降低(P<0.05),呈现下降趋势;而给药组小鼠G-CSF、TPO、IL-1β水平均明显升高(P<0.05,见表1),呈现上升趋势。

表1 沙棘黄酮对辐射损伤小鼠G-CSF、TPO、IL-1β水平影响

2.2 沙棘黄酮对辐射损伤后小鼠TNF-α水平影响

与空白对照组比较,造模后3,14d放射对照组和给药组小鼠TNF-α水平均有明显升高(P<0.05),且给药组明显低于放射对照组(P<0.05)。放射对照组造模后14 d小鼠TNF-α水平高于造模后3 d(P<0.05),给药组造模后14 d TNF-α水平低于造模后3 d(P<0.05,见表2)。

表2 受试小鼠造模3 d和14 d血清中TNF-α水平变化

2.3 沙棘黄酮对辐射损伤后小鼠BMNCs细胞周期及细胞凋亡率影响

与空白对照组相比,造模后第3和14天放射对照组BMNCs细胞周期检测G0/G1期细胞比例较高,S期比例减少(均P<0.05);与放射对照组相比,给药组G0/G1期细胞比例明显降低,S期细胞比例明显增高(均P<0.05)。与空白对照组比较,造模后第3和14天放射对照组BMNCs细胞凋亡率有明显增高(P<0.05),给药组与放射对照组比较,细胞凋亡率显著降低(P<0.05,见表3)。

表3 造模后3 d和14 d沙棘黄酮对小鼠BMNCs细胞周期和细胞凋亡率的影响

3 讨论

放射治疗是治疗恶性肿瘤的有效手段,可有效控制肿瘤细胞增殖和分化,但同时也会对正常组织造成辐射损伤,如骨髓抑制及造血系统损伤等。因此,目前亟待解决的问题就是如何减轻放射治疗后对造血系统的损伤。大量学者都致力于辐射防护剂的研究,并筛选出一些化学制剂,但存在价格较高及具有毒副作用等缺点。而我国传统的中草药及其有效成分已成为抗辐射损伤研究的热点。目前有研究已证实,辐射后动物组织及血液中发现抗氧化剂含量减少,同时伴有脂质过氧化产物增加[6]。虽然已经证实沙棘黄酮具有良好的抗氧化活性,但是目前对沙棘抗辐射损伤作用的研究较少。

在正常生理情况下,骨髓造血系统细胞增殖、分化及凋亡均受到造血调控因子调节[7]。G-CSF、TPO和IL-1β属于造血正性调控因子;而TNF-α属于负性调控因子[8]。当机体遭受辐射损伤时负性调控因子增加明显,从而打破了体内造血调控因子间的平衡,表现为不同程度的造血功能障碍[9]。本实验结果显示,与放射对照组比较,给药组造模后灌胃给药3,14 d小鼠G-CSF、TPO水平明显升高,且造模后给药14 d小鼠G-CSF、TPO和IL-1β水平明显高于造模后3 d,此结果提示沙棘黄酮能够提高辐射损伤后小鼠造血正性调控因子水平,并在一段时间内使正性调控因子保持较高水平。与放射对照组比较,给药组造模后灌胃给药3,14 d小鼠TNF-α水平明显降低,且造模后灌胃干预14 d小鼠TNF-α水平低于造模后3 d,此结果提示沙棘黄酮对于辐射损伤后小鼠造血负性调控因子TNF-α水平具有下调作用,而且可以保持下调趋势。目前有大量关于细胞周期的研究,细胞周期存在多个关键的调控点,其中G1期向S期最容易受到外界干扰[10]。另外,有研究报道表明辐射损伤可诱导细胞凋亡,而细胞凋亡是辐射损伤所致骨髓细胞死亡的主要方式[11]。本实验结果提示,实验小鼠经一次性全身照射后BMNCs大多被阻滞于G0/G1期,S期比例明显降低,BMNCs细胞凋亡率较空白对照组明显增多;而给药组与放射对照组对比发现,G0/G1期细胞比例出现了明显降低,S期细胞比例明显增高,细胞凋亡率也出现明显降低。据此我们可以推断加速BMNCs细胞周期由G0/G1期向S期转换,减少放射损伤引起的骨髓细胞凋亡是沙棘黄酮产生抗辐射造血损伤作用的途径,从而起到改善辐射受损后的骨髓造血功能的作用。

总之,本研究结果表明,沙棘黄酮对辐射后小鼠造血调控因子产生调节作用,而且能够加速BMNCs细胞周期由G0/G1期向S期转换,减少放射损伤引起的骨髓细胞凋亡。这一结果为沙棘黄酮应用于抗辐射损伤提供了一定的理论依据,也为传统蒙药沙棘在抗辐射损伤领域的应用奠定了一定的基础。