幽门螺杆菌上调miR-7致胃上皮细胞GES-1凋亡

鄢春锦,刘 芬,严晓丹,姜 成

(福建中医药大学中西医结合学院病原生物学教研室,福州 350122;*通讯作者,E-mail:jc123666@sina.com)

microRNA(miRNA)是一类非编码小分子RNA,长约22 bp,具有在转录后水平调控基因表达的功能。研究表明,感染幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,Hp)后胃黏膜的多种miRNA表达水平发生改变,影响了胃上皮细胞增殖、凋亡、炎性反应、癌基因或抑癌基因的表达,参与消化道疾病的发生和发展[1]。miR-7是一类较为保守的miRNA,2001年被发现,位于第9号染色体,有miR-7-1、miR-7-2、miR-7-3三种不同的DNA序列,但其成熟序列相同。据报道miR-7在多种肿瘤中表达下降,如MALT淋巴瘤、胃癌、宫颈癌、结直肠癌、乳腺癌等[2-4],具有抑增殖促凋亡的作用。

人们早先观察到Hp感染可致胃上皮细胞凋亡[5],本课题组前期研究工作同样表明,幽门螺杆菌感染可抑制正常胃上皮细胞GES-1的生长[6],并导致细胞凋亡[7],前期研究也发现细胞细菌比1∶50与1∶100这两种浓度和24 h与48 h这两种感染时间对细胞的增殖凋亡影响显著,适合用于在后续实验中对其凋亡机制做进一步探讨。

在Hp致细胞凋亡过程中,具有抑增殖促凋亡作用的miR-7是否起了作用?如果确实有,那么miR-7是如何起作用的,其靶基因可能是什么?

根据生物学信息软件TargetScan、miRBase和相关文献报道[8],NF-κB成员RELA是miR-7的靶基因,miR-7可通过抑制RELA表达改变NF-κB通路活性,抑制下游分子包括与细胞增殖凋亡有关分子如Bcl-2家族蛋白表达,从而影响细胞的增殖凋亡。

为此我们假设:幽门螺杆菌通过调控miR-7水平改变靶基因RELA的表达,导致感染细胞凋亡。为了验证这一假设,我们进行了以下实验。

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 细菌培养

Hp细菌培养在含抗生素混合液的布氏培养基(含5%脱纤维冻融羊血),37 ℃饱和湿度烛缸培养3 d,用接种环刮取培养基上的Hp活菌,悬于少量PBS液中,用分光光度计测定其吸光度A值[9],1A660 nm为1×108cfu/ml。

1.3 细胞培养

用1%双抗10%胎牛血清的高糖DMEM培养,培养环境为5%CO2、37 ℃饱和湿度的二氧化碳培养箱。当细胞生长达到80%融合时,用0.25%胰蛋白酶消化传代。

1.4 Hp对GES-1细胞miR-7及RELA表达影响的实验分组

将细胞接种贴壁培养7 h,按一定比例感染细菌继续培养。细菌感染时换不含抗生素培养基培养。分析细菌感染量对细胞miR-7表达的影响时,感染时间定为24 h,感染组分为1∶50组(细胞∶细菌)和1∶100组;分析感染时间对细胞miR-7表达的影响时,感染率为1∶100,感染时间组分为24 h组和48 h组。在Hp感染对细胞RELA蛋白表达的影响实验中,感染组分为1∶50组和1∶100组,感染48 h。同时设未感染细胞为空白对照组。

1.5 瞬时转染GES-1细胞构建miR-7过表达细胞模型

1.6 细胞增殖能力的测定

采用CCK-8法检测细胞增殖情况。在96孔板进行细胞培养处理,培养48 h后加入10 μl CCK-8溶液,孵育1.5 h。用酶标仪测定450 nm处的吸光度A值。细胞增殖相对值=实验组A值/对照组A值×100%。

1.7 实时荧光定量PCR检测miR-7

1.7.1 样品总RNA提取 样品中加氯仿,剧烈振荡15 s,室温放置3 min,12 000 r/min离心10 min。取上清转入到新的离心管,加入1.5倍体积的无水乙醇,涡旋混匀,得到样品总RNA混合物。

1.7.2 小分子RNA纯化及富集 将混合物加入一个吸附柱RA中,12 000 r/min离心30 s,弃掉废液。加Wash Solution 1,12 000 r/min离心30 s,弃掉废液。将吸附柱RA放回空收集管中,12 000 r/min离心2 min。加入Wash Solution 2/3,12 000 r/min离心30 s,弃掉废液,重复2遍。取出吸附柱RA,放入一个RNase free离心管中,加RNase free water室温放置1 min,12 000 r/min离心1 min。

1.7.3 逆转录cDNA 逆转录反应体系19 μl: Gene Specific Primer(RT:2 μmol/L)1 μl、Hiscript Enzyme Mix 1 μl、Rnase-free H2O 4 μl、总RNA 3 μl、2×RT Mix 10 μl混匀。逆转录条件为50 ℃ 15 min,85 ℃ 2 min,4 ℃保存;其中miR-7-5p的RT引物为5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGAT ACGACAACAAC-3′;U6的RT引物为5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′。逆转录产物贮存于-20 ℃。

1.7.4 实时定量PCR 20 μl反应体系:cDNA 2 μl,上下游引物(2 μmol/L)各0.4 μl,2×plus SYBR real-time mixture 10 μl,ddH2O 6.8 μl,ROX Ⅰ 0.4 μl。反应条件Stage1:95 ℃ 60 s;Stage2:94 ℃ 20 s,60 ℃ 20 s,72 ℃ 30 s,共40个循环;Step3:95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,95 ℃ 15 s,60 ℃ 15 s。miR-7-5p引物F:5′-CGCGCGTGGAAGACTAGTGATTTT-3′,R:5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′;U6引物F:5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′,R:5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′。miR-7相对表达量是以U6 snRNA基因为内参,通过2-ΔΔCt方法获得。

1.8 Western blot法检测RELA蛋白

用RIPA裂解液裂解细胞,BCA法蛋白定量,进行SDS-PAGE蛋白质电泳,浓缩胶浓度5%,分离胶浓度10%,电转移法将蛋白转移到PVDF膜,放入封闭液里封闭。按说明书比例配好一抗后,把膜放在自封袋中,4 ℃摇床过夜,用TBST漂洗滤膜3次,每次5 min。将膜放入二抗溶液中,室温摇床缓慢摇动1 h。膜用TBST漂洗3次,每次5 min。ECL显色。以GAPDH为内参,目的蛋白相对含量是以目的条带的光密度值与各自内参的光密度值之比值表示。各抗体的工作浓度如下:HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG 1∶4 000、HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG 1∶4 000、RELA抗体(兔抗)1∶1 000、GAPDH抗体(鼠抗)1∶3 000。

1.9 流式细胞仪检测细胞凋亡

收集转染后48 h细胞进行凋亡检测。细胞用不含EDTA的胰酶消化收集,用PBS洗涤细胞二次,离心收集细胞。在50 μl的Binding Buffer中加入5 μl 7-AAD染液,混匀收集细胞中加入上述7-AAD染液,混匀;室温、避光、反应5-15 min。反应后再加入450 μl的Binding Buffer混匀,加入1 μl Annexin Ⅴ-PE混匀,室温、避光、反应15 min;1 h内上机检测凋亡细胞。

1.10 数据处理和统计分析

2 结果

2.1 Hp感染对GES-1细胞miR-7及RELA表达的影响

2.1.1Hp感染对GES-1细胞miR-7表达的影响 结果显示,1∶50组和1∶100组与空白对照组比较miR-7表达增加,差异有统计学意义(P<0.05,见图1)。与空白对照组比较,24 h组和48 h组miR-7表达显著增加,差异有统计学意义(P<0.05,见图2)。说明Hp感染与miR-7表达存在时间、量效关系,Hp感染确实影响了miR-7表达。

与空白对照组比较,*P<0.05;与1∶50组比较,#P<0.05

与空白对照组比较,*P<0.05;与24 h组比较,#P<0.05

2.1.2Hp感染对GES-1细胞RELA表达的影响 结果显示与空白对照组比较,感染组RELA蛋白表达下降,其中1∶100组差异有统计学意义(P<0.05,见表1,图3)。

图3 不同感染组RELA表达情况

表1 Hp感染对GES-1细胞RELA表达的影响

2.2 过表达miR-7对GES-1细胞增殖、凋亡及RELA表达的影响

2.2.1 瞬时转染GES-1细胞构建miR-7过表达细胞模型 mimics组细胞中miR-7表达量显著高于空白对照组和NC组,差异有统计学意义(P<0.05,见表2),而NC组与空白对照组无显著差异,说明miR-7过表达细胞模型构建成功。

表2 miR-7 mimics转染GES-1细胞后miR-7表达

2.2.2 过表达miR-7对GES-1细胞增殖的影响 与空白对照组和NC组对比,mimics组细胞增殖能力下降,差异有统计学意义(P<0.05,表3),而NC组与空白对照组差异无统计学意义,说明miR-7抑制细胞的增殖。

表3 过表达miR-7对GES-1细胞增殖的影响

2.2.3 过表达miR-7对GES-1细胞凋亡的影响 与空白对照组和NC组对比,mimics组细胞凋亡率上升,差异有统计学意义(P<0.05),而NC组与空白对照组比较差异无统计学意义(见图4、表4),表明miR-7促进细胞的凋亡。

图4 过表达miR-7对GES-1细胞凋亡的影响

表4 过表达miR-7对GES-1细胞凋亡的影响

2.2.4 过表达miR-7对GES-1细胞RELA表达的影响 mimics组细胞中RELA蛋白表达量低于空白对照组和NC组,差异有统计学意义(P<0.05),而空白对照组和NC组比较无显著差异(见表5,图5),说明miR-7下调RELA的表达。

表5 过表达miR-7对GES-1细胞RELA表达的影响

图5 不同转染组RELA蛋白的表达

3 讨论

感染细胞的miR-7与细菌感染量及感染时间呈现出时效、量效关系,并且miR-7靶基因NF-κB成员RELA表达下调,说明幽门螺杆菌通过影响miR-7分子表达调控NF-κB通路。转染实验进一步证明:Hp通过调控miR-7分子,抑制其靶基因RELA的表达,改变NF-κB通路活性,对细胞的增殖凋亡发挥调控作用。这一调控通路与Zhao等[10]的报道一致,同时他们指出NF-κB通路的下游效应分子正是与细胞增殖有关的c-Myc,Cyclin D和Bcl-2家族蛋白,通过该条通路影响了细胞增殖和凋亡速率,使疾病向癌变方向发展。

对于幽门螺杆感染是促细胞增殖还是凋亡,存在矛盾的报道。Zhao等[10]的实验显示Hp感染导致miR-7下调,促进了细胞的增殖;相反，Targosz等[5]的实验证明幽门螺杆菌感染诱导了细胞凋亡,我们前期的实验支持这一观点[6,7]。造成实验结果不一致,可能有如下几方面原因:①实验对象方面,有的研究是以活体为研究对象[2,11],而体内影响因素众多,除细菌因素外还有机体免疫炎症反应的复杂影响,可因炎症反应下调miR-7表达。②细菌菌株方面,miRNA的表达变化与Hp的菌株毒力有关。据报道,具有CagA+的菌株可引导miR-584、1290过表达,而CagA-的菌株则不能[12]。③疾病发展阶段,有的实验关注肿瘤阶段,认为miR-7下降与肿瘤的增殖、侵袭、迁移相关[2,12,13],而有的实验则关注由慢性炎症向胃癌转变阶段[10,11],对miR-7在早期单纯因细菌感染引发凋亡的作用不明确。在我们的实验中,选用正常胃黏膜细胞GES-1为研究对象,Hp菌株为VacA+、CagA+菌株,观察感染早期Hp对miR-7表达、NF-κ B信号通路活性以及细胞凋亡的影响,希望为揭示细菌感染早期致病机制提供见解。

从幽门螺杆菌感染引发胃黏膜上皮细胞变性,到慢性炎症向胃癌转变过程中,miR-7起到了怎样的作用?其表达在整个过程中的变化规律是怎样的?是否会由高向低转化?还有哪些靶基因或通路参与了miR-7相关的调控?这漫长疾病发生发展过程,应该是个复杂的多分子多通路参与的过程,这些问题都有待今后研究揭示。