外周血及肿瘤组织中膜联蛋白 A 3、缺氧诱导因子-1α表达对结直肠癌铂类耐药的预测价值

朱利芹，宗明珠，杜楠#

1复旦大学附属华山医院静安分院呼吸科，上海 200040

2淮安市第一人民医院肿瘤内科，江苏 淮安 223300

结直肠癌为消化系统中一种常见的恶性肿瘤，发病率仅次于胃癌，居消化系统恶性肿瘤的第二位。目前结直肠癌主要采用手术治疗，但结直肠癌早期多无典型表现，症状易与其他肠道、肛周疾病混淆，因此多数患者确诊时病情已经进展至中晚期而失去了最佳手术时机。另有部分患者因肿瘤体积较大、粘连程度较严重或肿瘤处于低位接近肛周，而使手术治疗保肛难度加大。即使成功开展手术治疗，结直肠癌术后仍具有较高的复发率。因此于围手术期给予辅助化疗已经成为结直肠癌手术治疗的重要组成部分。辅助化疗能够增加手术治疗机会，提高保肛率，辅助杀灭术后残余微小肿瘤病灶，预防复发，延长患者生存时间。铂类药物为目前结直肠癌化疗的常用药物，当患者对铂类药物耐药时可直接影响化疗疗效，对患者的手术治疗、预后均构成严重不良影响。因此预测结直肠癌对于铂类药物是否耐药，可为化疗药物的选择提供重要参考。膜联蛋白A3、缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）可通过多种途径提高结直肠癌细胞对于铂类药物的耐药性。本研究客观评估膜联蛋白A3与HIF-1α在结直肠癌对铂类药物耐药性预测中的应用价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2013年1月至2020年6月淮安市第一人民医院收治的结直肠癌铂类药物化疗患者的病历资料。纳入标准：①经手术病理或活检确诊为结直肠癌；②美国癌症联合委员会（American Joint Committee on Cancer，AJCC）结直肠癌TNM分期系统（第7版）分期为Ⅱ～Ⅲ期；③相关资料完整。排除标准：①合并其他恶性肿瘤；②化疗前接受过分子靶向治疗和（或）免疫治疗；③有免疫功能异常史；④有血液系统疾病史。根据纳入、排除标准，共纳入102例结直肠癌铂类药物化疗患者，按首个化疗周期对铂类药物的敏感情况划分为有效组（63例）与耐药组（39例）。有效组患者中，男39例，女24例；年龄46～81岁，平均（64.07±8.96）岁；TNM分期：Ⅱ期37例，Ⅲ期26例。耐药组患者中，男24例，女15例；年龄48～79岁，平均（63.84±8.71）岁；TNM分期：Ⅱ期22例，Ⅲ期17例。两组患者年龄、性别、TNM分期比较，差异均无统计学意义（P﹥0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 评价标准 全部患者均接受铂类药物化疗，于1个化疗周期结束后评估耐药情况。以化疗后与化疗前相比肿瘤病灶未见缩小，达实体瘤疗效评价标准的无效标准；化疗结束后达完全缓解，随后于6个月内出现复发；符合任意一种情况为耐药，无上述表现为敏感。以此结果为金标准，并据此分组。

1.2.2 外周血检测 于入院后治疗前采集全部患者清晨空腹肘前静脉血5 ml，滴加抗凝剂后于无菌室内22～26℃静置20 min，置入离心机，离心半径设置为12.5 cm，转速设置为3000 r/min，处理10 min取得血清。按化学发光免疫分析法检测膜联蛋白A3水平，按酶联免疫吸附法检测HIF-1α水平，操作步骤按试剂盒说明书执行。

1.2.3 肿瘤组织免疫组化检测 于术前活检时采集全部患者的肿瘤组织。采用免疫组织化学染色检测肿瘤组织中膜联蛋白A3、HIF-1α水平，行二甲苯脱蜡，梯度酒精洗脱，使用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）冲洗 3次后，滴加0.01 mol/L的枸橼酸缓冲液，煮沸后修复抗原，加入3%的HO孵育3 min，清除内源性过氧化酶。加3%的山羊血清封闭液体，于37℃条件下孵育10 min，弃去封闭液；分别滴加1∶500鼠抗人膜联蛋白A3单克隆抗体、鼠抗人HIF-1α抗体，于4℃条件下孵育过夜。以PBS冲洗3次后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）二抗，37℃下孵育30 min，以PBS冲洗3次；随后加入新配置的二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色液，以自来水冲洗、复染、封片。结果判定：由两位病理科医师采用双盲法阅片，于显微镜下随机选取10个视野，依据肿瘤细胞染色强度与阳性细胞占比评定。染色强度：染色与阴性对照一致计0分，淡黄色染色计1分，棕黄色染色计2分，褐色染色计3分。阳性细胞占比：0%～25%计1分，26%～50%计2分，51%～75%计3分，﹥75%计4分。两项评分之和作为评价结果，合计计分﹤4分为阴性，≥4分为阳性。

1.3 观察指标

对比有效组与耐药组患者外周血与肿瘤组织中膜联蛋白A3、HIF-1α表达水平，分析外周血及肿瘤组织中膜联蛋白A3、HIF-1α表达水平及二者联合应用对结直肠癌铂类耐药的预测价值。外周血与肿瘤组织中膜联蛋白A3、HIF-1α联合应用采用Logistic拟合。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 外周血中膜联蛋白 A 3、HIF-1 α表达水平的比较

耐药组患者外周血中膜联蛋白A3、HIF-1α表达水平均明显高于有效组，差异均有统计学意义（P﹤0.01）。（表1）

表1 两组患者外周血中膜联蛋白 A 3、HIF-1 α表达水平的比较（±s）

2.2 肿瘤组织中膜联蛋白 A 3、HIF-1 α对铂类耐药预测价值的ROC分析

肿瘤组织中膜联蛋白A3、HIF-1α及二者联合对结直肠癌铂类耐药均具有中等预测价值。（表2、图1）

表2 肿瘤组织中膜联蛋白 A 3、HIF-1 α对铂类耐药预测价值的ROC分析

图1 肿瘤组织中膜联蛋白A 3、HIF-1 α单独及联合应用对铂类耐药预测价值的ROC曲线

2.3 外周血中膜联蛋白 A 3、HIF-1 α对铂类耐药预测价值的ROC分析

外周血中膜联蛋白A3与HIF-1α联合应用对结直肠癌铂类耐药具有较高预测价值，膜联蛋白A3最佳截断值为1.970 mg/L，灵敏度为76.92%，特异度为100%；HIF-1α具有中等预测价值，最佳截断值为183.750 pg/ml，灵敏度为76.92%，特异度为68.25%。（图2、表3）

表3 外周血中膜联蛋白 A 3、HIF-1 α对铂类耐药预测价值的ROC分析

图2 外周血中膜联蛋白A 3、HIF-1 α单独及联合应用对铂类耐药预测价值的ROC曲线

3 讨论

结直肠癌为临床上一种常见的恶性肿瘤，化疗在结直肠癌的治疗与手术综合治疗中均具有重要作用。铂类药物为结直肠癌化疗的常用药物，但患者对于铂类药物的敏感性具有较大的个体差异。结直肠癌患者对铂类药物的耐药性可直接影响化疗效果，对患者的术后复发与预后生活质量造成严重不良影响。因此尽早预测患者对铂类药物的耐药性，应用更为敏感的化疗药物能够提高结直肠癌的临床疗效，降低复发率，改善患者生活质量。

HIF-1α是一种参与结直肠癌诸多信号通路，发挥调控肿瘤血管生成、控制肿瘤细胞增殖与能量代谢、抑制肿瘤细胞凋亡的细胞因子。在化疗过程中肿瘤病灶内部形成许多乏氧细胞，HIF-1α可为这些乏氧细胞提供能量，从而提升了肿瘤细胞对化疗药物的耐药性，影响化疗疗效。HIF-1α高表达时不仅能够提高结直肠癌对化疗的敏感性，同时还具有促进结直肠癌进展与转移的作用。膜联蛋白A3是一种Ca依赖磷脂结合蛋白，与肿瘤细胞的诸多生物功能具有密切相关性。在膀胱癌、肺癌、卵巢上皮癌等恶性肿瘤组织中膜联蛋白A3均可见异常高表达，提示膜联蛋白A3与包括结直肠癌在内的诸多恶性肿瘤的发生、发展均具有相关性。谢祥红和刘芳研究认为膜联蛋白A3能够降低肿瘤细胞内部铂类药物与DNA的结合水平，从而导致肿瘤细胞对铂类药物耐药。在顺铂作用后的肿瘤细胞中，膜联蛋白A3高表达的肿瘤细胞成瘤率明显高于膜联蛋白A3低表达的肿瘤细胞，但膜联蛋白A3对紫杉醇、表柔比星等药物作用后的细胞成瘤率并未见明显差异。因此提示膜联蛋白A3极大可能为铂类特异性耐药分子标志蛋白。

本研究结果表明，耐药组患者外周血中膜联蛋白A3、HIF-1α表达水平均高于有效组，提示耐药组患者外周血中膜联蛋白A3、HIF-1α表达水平具有作为结直肠癌铂类耐药标志物的理论可行性。经ROC曲线分析，外周血中膜联蛋白A3对结直肠癌铂类耐药具有较高预测价值，当结直肠癌患者外周血中膜联蛋白A3﹥1.970 mg/L时提示患者对铂类药物耐药，此时的灵敏度为76.92%，特异度为100%；当结直肠癌患者外周血中HIF-1α﹥183.750 pg/ml时提示患者对铂类药物耐药，此时的灵敏度为76.92%，特异度为68.25%；提示外周血中膜联蛋白A3水平对于铂类耐药的预测价值更高。在外周血与肿瘤组织中，膜联蛋白A3与HIF-1α联合应用时均可提高预测价值。

综上所述，外周血与肿瘤组织中膜联蛋白A3与HIF-1α水平对结直肠癌铂类耐药的预测价值具有一定差异，但均具有中等至较高的预测价值，且二者联合应用时可提高预测价值；其中外周血中膜联蛋白A3与HIF-1α水平具有量化性，且取材便捷、重复性好。本研究中尚未涉及膜联蛋白A3与HIF-1α的联合应用，且研究纳入病例数较少，有待于进一步研究明确。