五种相关光合蛋白基因在马铃薯野生种冷驯化中的表达分析

吴巧玉， 何天久

(贵州省农业科学院生物技术研究所, 贵阳 550006)

马铃薯(SolanumtuberosumL.)是茄科茄属一年生草本植物，粮菜兼用，是仅次于小麦、稻谷和玉米的第四大粮食作物[1]。低温霜冻是影响马铃薯生产的重要自然灾害之一，而马铃薯普通栽培种不耐霜冻，在气温低于7 ℃时停止生长，-1.5 ℃受冻害[2]。植物经过非致死温度的低温处理可以获得更强的抗寒能力，这种现象被称为冷驯化[3]，植物冷驯化能力是一个的多基因性状，涉及大量的基因相互作用[4]。

光合作用是一系列复杂的代谢反应的总和，温度是决定光合作用最关键的自然因素之一。Bilska等[5]研究表明，光合作用对低温最为敏感。当植物遭受低温胁迫时，植物叶绿体结构遭到破坏，光合速率下降，从而导致植物光合作用下降[6]。Norman等[7]研究表明，光合作用为冷驯化过程提供了碳骨架和能量，从而抵御低温胁迫。低温胁迫也会影响活性氧清除系统和光合作用相关酶系活性，加速活性氧在植物叶绿体内积累，影响D 1蛋白合成及周转[8]。这些研究结果表明，光合作用在植物低温胁迫中发挥了重要作用，因此研究冷驯化过程中一些光合作用相关蛋白有助于解析植物冷驯化能力涉及的代谢途径。

目前关于马铃薯冷驯化能力的分子机制研究较少。前期对两种马铃薯野生种冷驯化过程中蛋白组分析(数据待发表)发现，五种光合蛋白基因(叶绿体细胞色素f、叶绿体放氧增强蛋白1、叶绿体锰稳定蛋白-Ⅱ、叶绿体光系统Ⅱ修复蛋白PSB 27-H 1、叶绿体甘油醛-3-磷酸脱氢酶)在冷驯化期上调表达，推测该基因与冷驯化能力相关。因此，本研究以马铃薯野生种S.acaule(W 3，抗冻、具冷驯化能力)和S.cardiophyllum(Cph 12,霜冻敏感、不具冷驯化能力)为研究对象，通过荧光定量PCR，研究这五种光合蛋白基因在冷驯化期间的转录表达量，以期阐明其在马铃薯冷驯化过程中的功能。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试材料为马铃薯野生种W 3和Cph 12，均从国家马铃薯中心引进。材料经脱毒培养，试管苗种植于贵州省农业科学院温室大棚。在苗期(植株有5～7片完全展开的复叶)取长势一致的植株，在人工气候箱(AHRP-2000 D,常州)内培养2 d，培养条件为：温度(20±0.5)℃、相对湿度(70±5)%、光/暗(14 h/10 h)培养、光照强度100 μmol·(m2·g)-1；随后开始进行冷驯化，驯化条件为：白天4 ℃14 h，光照强度100 μmol·(m2·g)-1；夜间2 ℃10 h，黑暗。在冷驯化第0、4、8、12天，分别取W 3和Cph 12整个植株用于抗冻性鉴定，并取叶片(从顶端往下第3、4片展开复叶)用于光合速率、叶绿素及qPCR检测。

1.2 抗冻性鉴定

在冷驯化的0 d、4 d、8 d、12 d各取9株材料进行抗冻性评价，所选材料在低温人工气候箱(PAX-250 C，常州)内-5 ℃黑暗条件下处理3 h，随后在20 ℃、光照强度100 μmol·(m2·g)-1条件下培养24 h，进行冷冻损伤评分。评分标准采用Wu等[9]的方法，具体标准为：0=没有损伤；1=顶部叶片轻微伤害；2=顶部的一些叶片被冻死；3=所有顶部叶片冻死；4=所有叶片和小叶柄冻死；5=叶片和茎干冻死。计算各试验受损程度的伤害指数(DI)。

DI =(x 0+x 1+x 2+x 3+x 4+x 5)/处理总数，

式中，x 0～x 5代表不同损害等级的评估值之和。

1.3 叶绿素及光合测定

叶绿素采用叶绿素含量分析仪(SPAD-502，日本)测定展叶(由顶部往下第4片叶)叶绿素含量；光合速率采用LI-6400 XT便携式光合作用测量系统(LI-COR，美国)测定同一叶片的净光合速率，测定时光照设定为800 μmol·(m2·s)-1。

1.4 qRT-PCR检测

在冷驯化的0 d、1 h、1 d、4 d、8 d与12 d取展叶(由顶部往下第4片叶)，液氮冻存，用于荧光定量PCR检测目的基因表达量。RNA采用试剂盒(OMEGA，美国)抽提。cDNA反转录用试剂盒(GenStar，中国)进行。荧光定量PCR试剂选用2×RealStar Green Fast Mixture(GenStar，中国)，仪器为BIO-RAD C 1000 Touch Thermal Cycle。PCR程序设置为95 ℃ 5 min,(95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s)40个循环，在每循环的复性阶段读取荧光强度。熔解曲线程序采用仪器默认设置，具体为：95 ℃ 10 s，65 ℃至95 ℃(每5 s增加0.5 ℃，并读取荧光强度)。所选用引物如表1所示。

1.5 数据分析

试验进行3 次重复，数据均以平均数±标准偏差表示。采用Excel 2007 软件对数据进行统计分析并作图，使用SPSS 21 软件进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 抗冻性鉴定

如图1所示，冷驯化前(0 d)，W 3与Cph 12在-5 ℃所受冻害无显著性差异。随着冷驯化的进行，W 3的抗冻性逐步增强，到12 d时，植株可以经受-5 ℃的低温而无明显冻害性状；Cph 12的抗冻性随冷驯化时间的延长无明显变化。到12 d时，-5 ℃的低温处理导致植株全部死亡。

2.2 冷驯化过程中马铃薯野生种叶绿素和光合速率含量变化

两种马铃薯野生种冷驯化过程中叶片叶绿素及光合速率变化结果见图2。从图2可知，W 3植株叶片净光合速率在冷驯化前期显著降低；随着冷驯化时间的延长，逐步恢复。而Cph 12中叶片净光合速率在前期降低后，虽然在后期有所增加，但是未达到显著水平。与之相对应，W 3叶片中叶绿素含量有一个显著的增加过程，而Cph 12中叶绿素含量始终无显著性变化。

2.3 qRT-PCR检测结果

以微管蛋白为内参，5个蛋白基因：叶绿体放氧增强蛋白1、叶绿体甘油醛-3-磷酸脱氢酶、叶绿体锰稳定蛋白-Ⅱ、叶绿体细胞色素f、叶绿体光系统Ⅱ修复蛋白PSB 27-H 1、在冷驯化期间的转录表达量结果见图3。由图3可知，叶绿体放氧增强蛋白1、叶绿体锰稳定蛋白-Ⅱ与叶绿体细胞色素f在转录水平先降低，后升高，再降低。叶绿体光系统Ⅱ修复蛋白PSB 27-H 1在转录水平先升高，后降低。叶绿体3-磷酸甘油醛脱氢酶在W 3中先升高，后降低；在Cph 12中先降低，后升高，再降低。结果表明，所选择基因在转录水平的变化规律在两个材料中具有较大的相似性。

3 讨论与结论

光自养生物可以根据温度和辐照度的变化来调整光合组织的结构和功能，以维持细胞能量平衡；而温度或辐照度的变化都会导致细胞内能量的不平衡[7]；活性氧在低温下过度积累，使光系统Ⅰ和Ⅱ的光合反应过程中吸收的能量与卡尔文循环中消耗的能量不平衡，导致氧化应激[11]。光合生物可以通过光合电子传递链的氧化还原状态来感知温度的变化，而氧化还原状态又通过调节核基因表达和叶绿体生物合成来控制表型[7]。

植物冷驯化是一个需要能量的过程，从来源考虑，能供给冷驯化所需的能量只有前期储藏的能量和光合作用固定的光能；当前者不足时(如植株苗期，或者植物处于低温条件时间过长等情况)，光合系统能够在冷驯化条件下发挥作用，成为植物冷驯化能力实现的必要条件。Smith等[12]研究表明，通过增加光合作用限速酶Rubisco含量，可以有效增强玉米的耐冷性。本研究表明，冷驯化过程中，W 3中叶绿素(Chl)含量显著升高，而Cph 12中Chl含量变化未达到显著水平；与之相对应，W 3植株净光合速率在冷驯化前期显著降低，后期逐渐恢复到冷驯化前的水平，而Cph 12中植株净光合速率在前期降低后，后期未见显著恢复。该结果在一定程度上支持前述结论。

植物的抗寒性是受多基因控制的数量性状，其抗寒性状的表达需要经过一定时间和温度的诱导[13]。李飞[14]研究发现，马铃薯野生种S.acaule具有冷驯化能力，冷驯化处理可以将其半致死温度(LT 50)从-6～-4 ℃提高到-10～-8 ℃。不同植物的冷驯化能力差异是由基因决定的[15]。本研究通过qRT-PCR技术对马铃薯野生种冷驯化过程中涉及光合表达的五种蛋白基因的表达进行分析，结果表明，马铃薯冷驯化过程中，这五种光合相关基因的转录表达确实发生了改变，其中叶绿体放氧增强蛋白1、叶绿体锰稳定蛋白-Ⅱ、叶绿体细胞色素f、叶绿体光系统Ⅱ修复蛋白PSB 27-H 1在转录水平的变化在两种材料中表达具有较大的相似性；而叶绿体甘油醛-3-磷酸脱氢酶在W 3进行冷驯化1 h后即开始显著上调表达，到第4天，其表达量显著降低，表明其参与了马铃薯对冷驯化低温环境的应急响应过程。李娜娜等[16]研究表明，高温胁迫下sHSP 26 通过调控光合作用相关蛋白(如放氧增强子蛋白、叶绿素a/b 结合蛋白、细胞色素b 6/f 复合体铁硫亚基等)来影响玉米叶绿体的耐热性。蒋乐等[17]利用短日照处理油松容器苗蛋白组学分析发现，叶绿体放氧增强蛋白 1和甘油醛-3-磷酸脱氢酶上调表达，表明光合代谢参与油松容器苗的抗逆性。

综合上述结果推测，光合系统对冷驯化条件的适应可能是马铃薯冷驯化能力实现的必要条件。