基于网络药理学研究荷叶碱对多囊卵巢综合征的作用机制※

张靖悦 赵恒侠 陈宇阳 连李荣

(广州中医药大学第四临床医学院2019级硕士研究生，广东 深圳 518033)

多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是育龄期女性常见的以高雄激素及持续无排卵或排卵障碍为特征的内分泌代谢异常的疾病，长期可导致生殖功能障碍，增加子宫内膜癌、心脑血管等疾病发病风险[1]。目前，PCOS发病机制尚不明确，胰岛素抵抗、低度炎性反应等与PCOS的发生相关[2]。西医治疗PCOS常对症予促排卵、调节月经周期、增加胰岛素敏感性等，但效果一般且有毒副作用[3]。

中药具有多成分、多靶点的特点，防治PCOS有一定优势。赵恒侠教授认为，痰浊阻滞为PCOS发病的主要病机，以轻清荷叶为君药，自拟“荷芪散(主要药物：荷叶、黄芪、苍术、香附、郁金、决明子等)”健脾除湿、升清降浊治疗PCOS。前期实验及临床观察证实，荷芪散具有改善PCOS大鼠及PCOS患者胰岛素抵抗、糖脂代谢，纠正性激素紊乱等作用，但缺少方中中药单体作用机制的研究[4-6]。

荷叶的有效成分主要包括生物碱类及黄酮类等[7-8]，其中荷叶碱为荷叶中富含的一种异喹啉类生物碱，是荷叶发挥药理作用的重要成分。目前研究证明，荷叶碱可减轻体质量，改善胰岛素抵抗[9]，减缓炎性反应[10]，因此推测荷叶碱可通过提高胰岛素敏感性及干预炎性反应起到治疗PCOS的作用。但荷叶碱作用靶点及通路众多，传统药理学研究思维方法单一，难以进行全面系统的分析。网络药理学以生物信息学、药理学、生物学等学科为基础，通过建立“成分-靶点-疾病”模型，全面、系统、多维度分析药物作用的潜在分子机制，现已被广泛应用[11]。本研究采用网络药理学研究荷叶碱对PCOS的作用靶点及通路，为后续研究提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 荷叶碱结构及作用靶点获取 ①利用Pubchem数据库(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)以“Nuciferin“为关键词检索获取荷叶碱的3D结构，导入Swiss Target Prediction数据库(http://www.swisstargetprediction.ch)得到荷叶碱的相关靶点；②利用中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform, TCMSP)(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)以“Nuciferin”为关键词，检索项为“Chemical Name”进行检索，获取荷叶碱的靶点。将上述2个来源的靶点汇总去重后得到荷叶碱的相关靶点，利用Uniprot数据库(http://www.uniprot.org)将靶点名称进行基因标准化。

1.2 PCOS疾病靶点获取 在GeenCard数据库(The Human Gene Database，http://www.genecards.org)、OMMI数据库(http://www.omim.org)输入“polycystic ovary syndrome”检索，获得PCOS的疾病相关靶点，汇总去重后利用Uniprot数据库规范靶点。

1.3 成分-疾病共同靶点筛选 借助Venny 2.1.0(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)在线工具将1.1项中获得的荷叶碱相关靶点与1.2项中获得的PCOS疾病靶点进行比对，取交集，并借助Venny 2.1.0在线工具绘制Venn图，利用Cytoscape软件建立“成分-靶点-疾病”网络图。

1.4 荷叶碱治疗PCOS靶点网络构建 将1.3项中获得的荷叶碱与PCOS疾病共同靶点基因输入STRING数据库，选择物种为“Homo sapiens”，隐藏游离位点，其余默认选项，构建蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction，PPI)网络，并用Cytoscape 3.8.1的Network Analyzer功能分析其网络拓扑参数，得到主要靶点并可视化。运用R语言软件绘制度(Degree)值前30位靶点(即核心靶点)的柱状图。

1.5 基因本体(gene ontology，GO) 功能富集分析及京都基因与基因组百科全书(kyotoencyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析 利用R软件的ClusterProfiler包将荷叶碱与PCOS的共同靶点进行GO功能富集分析以描述基因靶点的功能，包括生物过程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)和细胞组成(cellular component，CC)，并对交集基因进行KEGG通路富集分析以探讨荷叶碱作用的信号通路。GO功能富集分析和KEGG通路富集分析均以P<0.05表示差异有统计学意义，并用微生信平台绘制条形图，根据富集分析结果进一步探究荷叶碱治疗PCOS的分子机制。

1.6 成分-靶点分子对接 通过TCMSP下载荷叶碱结构的mol2格式文件，使用AutoDock对其进行加氢、加电子等修饰操作，以pdbqt文件格式输出，利用PDB数据库(http://www.rcsb.org)获取核心靶点蛋白3D结构的pdb格式文件，使用AutoDock软件去水、加氢、加电子后输出pdbqt格式文件，最后使用AutoDock对以上蛋白进行分子对接并获得相应结合能(binding energy，BE)，并利用Pymol软件将结果进行可视化。通过BE评价靶点与蛋白之间的结合活性，BE越低，结合活性越大，发生作用可能性越大。

2 结果

2.1 靶点获取结果 通过Swiss Target Prediction数据库及TCMSP数据库检索荷叶碱有效靶点，汇总去重后共得到83个靶点，利用GeenCard数据库和OMMI数据库检索PCOS疾病靶点，汇总去重后共得到2575个靶点。

2.2 成分-疾病共同靶点筛选结果 将2.1项中获得的荷叶碱靶点与PCOS疾病靶点比对取交集后得到交集靶点36个，推测这些靶点可能是荷叶碱治疗PCOS的潜在靶点，见表1、图1；“成分-靶点-疾病”网络图，见图2。

表1 荷叶碱治疗PCOS潜在靶点

图1 荷叶碱-PCOS交集靶点Venn图

图2 “成分-靶点-疾病”网络图

2.3 荷叶碱治疗PCOS靶点网络构建结果 将交集靶点输入STRING数据库构建PPI网络，并利用Cytoscape 3.8.1可视化，生成荷叶碱治疗PCOS靶点PPI网络图，见图3。PPI网络中除去游离靶点DDP4、NR4A1、FDFT1，共得到33个节点，146条边，其中节点图标越大，颜色越深接近墨绿色则在网络中作用越大，边越粗表明相互作用关系越强。网络拓扑分析示，网络平均度值为8.11，度值越高，表明越倾向为关键蛋白，度值排名前30的靶点绘制核心靶点基因条形图(见图4)，推测SLC6A4、DRD2、MAOA、OPRM1、SLC6A3为荷叶碱治疗PCOS的核心靶点。

图3 荷叶碱治疗PCOS靶点PPI网络图

图4 核心靶点基因度值条形图

2.4 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析结果 GO功能富集分析共获得1230个条目，其中MF 77个，包括DNA结合转录因子结合、核受体活性、蛋白激酶活性、氧化还原酶活性、泛素蛋白连接酶结合、核受体结合、整合素结合等；BP 1115个，包括对激素的反应、对无机物的反应、对凋亡信号通路的调控、对缺氧的反应等；CC 38个，包括质膜蛋白复合物、转录调节复合体、髓鞘、囊泡腔、线粒体外膜、质膜外侧等，按照-lgP值由大到小排序，对排名前10位的条目进行展示，见图5。KEGG通路富集分析共得到149条通路(P<0.05)，涉及神经活性配体-受体相互作用(Neuroactive ligand-receptor interaction)、5-羟色胺能突触(Serotonergic synapse)、钙信号通路(Calcium signaling pathway)、多巴胺能突触(Dopaminergic synapse)、cAMP信号通路(cAMP signaling pathway)，按-lgP值由大到小排序，对排名前20的通路进行展示，见图6。

图5 GO功能富集分析条形图

图6 KEGG通路富集分析条形图

2.5 成分-靶点分子对接结果 将荷叶碱活性成分与SLC6A4、DRD2、MAOA、OPRM1、SLC6A3 5个核心靶点进行分子对接，见表2、图7。结果显示，荷叶碱与上述5种核心靶点蛋白均能良好结合。

表2 核心靶点与荷叶碱分子对接结果

图7 SLC6A4、DRD2、MAOA、OPRM1、SLC6A3与荷叶碱分子对接图

3 讨论

本研究基于网络药理的方法，对荷叶碱治疗PCOS进行系统全面的研究。结果显示，荷叶碱治疗PCOS的潜在靶点有36个，SLC6A4、DRD2、MAOA、OPRM1、SLC6A3为荷叶碱治疗PCOS的核心靶点，可能通过5-羟色胺能突触、多巴胺能突触等发挥作用。分子对接研究结果表明，荷叶碱与SLC6A4、DRD2、MAOA、OPRM1、SLC6A3靶点的BE均小于-5 kcal/mol，均可生成氢键，说明其与潜在靶点的结合性较高，因此推测，荷叶碱未来可能成为治疗PCOS的有效化合物之一，可为新药的研发提供新思路。

5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)是单胺类化合物，又称血清素，主要由肠嗜铬细胞合成，作为一种抑制性神经递质，广泛存在于大脑皮层及神经突触内[12]。随着研究的不断进展，发现5-HT在中枢神经系统之外的许多系统如内分泌代谢系统等皆发挥着重要作用[12]。视前区(POA)和内侧基底下丘脑(MBH)控制排卵期前黄体生成激素(LH)和排卵数量的增加，而POA和MBA受来自脑干下部5-HT分泌的影响[13]。Maekawa F等[14]研究表明，位于脑干的中缝背核在诱导LH峰和排卵中起重要作用，5-HT受体系统参与了这一机制。唐怡等[15]和王建红等[16]研究表明，慢性刺激使5-HT含量下降，雌性鼠的促性腺激素释放激素(GnRH)含量亦下降。因此，5-HT与性激素分泌及女性排卵有一定相关性。

多巴胺(DA)系统是维持GnRH和LH基础分泌的重要因素。现有研究认为，可能由于体内类固醇激素水平的不同，DA对GnRH的释放有双向调控作用，即雌激素水平高时抑制GnRH的分泌，雌激素水平低时促进GnRH的分泌。PCOS患者表现为高雄激素血症，较高水平的雄激素在芳香化酶的作用下转化为较多的雌二醇和雌酮，因此多数研究认为，DA对PCOS患者GnRH有较强的抑制作用。国内外许多研究表明，PCOS患者表现为中枢性DA减少，从而引起LH异常分泌[18-19]。此外，PCOS患者多合并肥胖，而5-HT和DA神经递质系统可通过调节食欲改善肥胖[20]。5-HT影响肝脏局部的脂质储存，而不影响全身能量平衡[21]。5-HT还被发现通过HTR2A在脂肪组织中诱导脂肪生成[22]。DA作用的发挥很大程度上受3种酶COMT、MAOA和MAOB以及SLC6A3控制[23]。其中，MAOA还有平衡大脑中5-HT分泌的作用[24]。Need A C等[23]在一项研究对象均为女性的研究中发现，MAOA基因型与体质量和体质量指数(BMI)均显著相关，MAOA在肥胖者中表现为过量的低活性基因型。DRD2多态性亦与体质量相关[25]。

OPRM1是阿片类受体，广泛存在于大脑和机体的其他外周组织中。内源性阿片肽作为下丘脑GnRH分泌的抑制性调节剂，对卵巢功能有着重要的影响[26]。阿片类药物活性升高在高雄激素血症、高胰岛素血症的发病机制中起关键作用，长期阿片受体阻断治疗可以使高雄激素血症妇女的高胰岛素血症恢复正常[27]。内源性阿片类受体参与改善运动诱导的胰岛素抵抗，外周阿片类受体激活有助于改善受损的受体后胰岛素信号通路[28]。因此，推测OPRM1可以改善PCOS患者高雄激素血症以及胰岛素抵抗状态。

综上，本研究通过网络药理学的方法证实了荷叶碱通过多靶点、多通路治疗PCOS，对实验结果预测的核心靶点与荷叶碱进行分子对接均有良好的结合活性，结果与现有文献报道相吻合。进一步证明了网络药理学的可靠性，为进一步实验和临床研究提供了理论参考依据。但网络药理学可能存在疾病、药物靶点数据库信息不全等不足，因此仍需进一步开发健全完善精度更高的中药挖掘技术。