基于动物实验和网络药理学研究白竭散保留灌肠治疗溃疡性结肠炎的作用机制※

赵梦月 孙晓健 王宏昌 毛细云

(安徽中医药大学研究生院2019级硕士研究生，安徽 合肥 230012)

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一种病因不明的慢性非特异性肠道炎症性疾病，主要累及结肠黏膜(下)层，呈间断性腹痛、腹泻及黏液脓血便。目前，现代医学治疗UC虽可改善患者症状，但长期使用易出现耐药性，复发率高且易引起变态反应等毒副作用。各类炎症因子致结直肠黏膜及其功能损坏是导致UC发生的重要机制[1]，故修复黏膜溃疡是治疗UC的关键。中医在止血和敛疮生肌方面颇具优势，如中药保留灌肠，药物直达病灶，延长药物与病灶接触时间，缩短起效时长，不仅提高了生物利用度，且无明显毒副作用。白竭散为安徽省中医院院内制剂，可活血化瘀，止血止痛，生肌敛疮。本研究基于动物实验和网络药理学挖掘白竭散保留灌肠治疗UC的作用机制。

1 白竭散治疗UC实验研究

1.1 材料

1.1.1 动物 SPF级SD大鼠42只，雌雄各半，体质量(240±20)g，购自安徽医科大学，动物许可证号SCXK(皖)2017-001，并通过安徽中医药大学实验动物伦理委员会批准，实验前适应性喂养7 d，自由饮食水。

1.1.2 药品与试剂 白竭散药物组成：白及、龙血竭。0.23 g/mL白竭散混悬液(安徽省中医院)；美沙拉秦灌肠液[Vifor AG Zweigniederlassung Medichemie Ettingen(瑞士)，进口药品注册证号H20150127]；5%2,4,6-三硝基苯磺酸溶液(TNBS，Sigma)；10%水合氯醛溶液(北京百奥莱博科技有限公司)，4%多聚甲醛固定液(Biosharp)；便隐血试剂盒(珠海贝索生物技术有限公司)；苏木精、伊红染色液(安徽中医药大学实验中心)。

1.1.3 仪器 电子天平(梅特勒-托利多集团)；Olympus CX41显微镜(日本Olympus公司)；石蜡切片机(德国Leica)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及造模 将42只SD大鼠随机抽出10只为空白组，剩余32只大鼠禁食不禁水24 h，10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉，将直径为2 mm的橡胶软管自大鼠肛门缓慢插入8 cm，注入5% TNBS 0.6 mL，将大鼠倒立2 min，清醒后正常喂养。每日观察大鼠情况，记录体质量、粪便及隐血情况，若出现体质量下降、腹泻、脓血便，说明经过TNBS诱导的大鼠肠道已出现炎症表现，在32只大鼠中随机抽出2只，禁食不禁水，麻醉处死，剪取距肛门约8 cm肠道，400倍显微镜下观察结肠组织，见黏膜层炎症改变，溃疡形成，造模成功。余鼠30只按照随机数字表法分为3组，模型组、美沙拉秦组、白竭散组，每组10只。

1.2.2 药物干预与标本处理 造模成功后次日，按动物体表系数等效剂量法计算，白竭散组予白竭散混悬液2.3 g/(kg·d)灌肠，美沙拉秦组予美沙拉秦灌肠液0.7 g/(kg·d)灌肠，模型组、空白组予0.9%氯化钠注射液2 mL灌肠。每日固定时间灌肠1次，连续15 d。疗程结束后各组大鼠禁食不禁水24 h，麻醉处死，剪取距肛门约8 cm肠道，先在400倍显微镜下观察结肠组织，再用4%多聚甲醛固定液固定48 h，石蜡包埋，切片，苏木精-伊红(HE)染色，最后放置显微镜，400倍下观察HE染色后的组织切片。HE染色过程：脱蜡，覆水，苏木精染色液染色5 min，伊红染色液染色1～3 min(根据染色情况，适当增加或减少染色时间)，流水冲洗。

1.2.3 观察指标及方法 ①观察各组大鼠治疗后症状表现、结肠组织损伤情况。②比较各组大鼠疾病活动指数(DAI)、结肠黏膜损伤指数(CMDI)评分。DIA评分[3]，0分：体质量未降，大便结实，隐血阴性；1分：体质量降低1%～5%，大便轻度松散，隐血阴性；2分：体质量降低5%～10%，大便松软，隐血阳性；3分：体质量降低10%～15%，腹泻、稀便，隐血阳性；4分：体质量降低>15%，腹泻，肉眼脓血便。CMDI评分[1]，0分：无损伤；1分：局部充血水肿，无溃疡；2分：有溃疡，无明显炎症；3分：有溃疡，1处炎症；4分：多处溃疡和炎症，溃疡<1 cm；5分：多处溃疡和炎症，至少有1处溃疡>1 cm。③观察各组大鼠结肠组织HE染色结果。

1.3 结果

1.3.1 各组大鼠治疗后表现情况 空白组大鼠体质量无明显变化，活动量正常，精神反应灵敏，大便质软成形，无黏液脓血便；模型组大鼠活动量减少，体质量减轻，大便不成形，见脓血便；美沙拉秦组及白竭散组大鼠精神良好，反应尚灵敏，体质量基本正常，大便轻度松散，无黏液脓血便。

1.3.2 各组大鼠治疗后结肠组织损伤情况 空白组大鼠结肠壁结构完整，无损伤；模型组大鼠结肠壁可见多处溃疡，大小不等，直径最大约1.1 cm，炎症较重；美沙拉秦组及白竭散组大鼠结肠壁溃疡面较少，面积较小，炎性反应轻。

1.3.3 各组大鼠DAI、CMDI评分比较 见表1。

表1 各组大鼠DAI、CMDI评分比较 分，

由表1可见，模型组大鼠DAI及CMDI评分均高于空白组(P<0.05)；美沙拉秦组、白竭散组大鼠DAI及CMDI评分均低于模型组(P<0.05)；美沙拉秦组与白竭散组大鼠DAI及CMDI评分比较差异无统计学意义(P>0.05)。

1.3.4 各组大鼠结肠组织HE染色结果 空白组大鼠肠壁结构完整，未见明显炎症细胞；模型组大鼠肠壁结构不完整，固有腺体及腺上皮杯状细胞明显减少，固有间质及肠壁全层可见弥漫大量炎症细胞浸润，血管扩张充血，黏膜下层水肿明显，结构紊乱。美沙拉秦组及白竭散组大鼠染色结果基本一致,肠壁结构基本完整，可见部分修复，黏膜固有层水肿不明显，可见少量炎症细胞浸润，固有腺体及其杯状细胞数量较模型组增多，排列稍疏松，黏膜下层及固有肌层未见明显炎症细胞浸润。见图1。

图1 各组大鼠结肠HE染色结果 (HE，×400)

2 白竭散治疗UC的网络药理学分析

2.1 软件及数据库 中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php)、化源网(http://www.chemsrc.com)、Pubchem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)、SwissTargetPrediction &&SwissADME(http://www.swisstargetprediction.ch)、OMIM(https://omim.org)、Therapeutic Target Database(TTD，http://db.idrblab.net/ttd)、GeneCard(https://www.genecards.org)、PharmGKB(https://www.pharmgkb.org)、Drugbank(https://go.drugbank.com)、UniProt(https://www.uniprot.org)、Disgenet(https://www.disgenet.org/)、String(https://cn.string-db.org/cgi/input.pl)，可视化网络绘制图软件Cytoscape 3.7.2，专业型化学结构式编辑器King Draw V 1.2.2,微生信在线绘图工具(http://www.bioinformatics.com.cn)。

2.2 白竭散有效成分及靶点筛选 以“白及”“龙血竭”为关键词，通过使用TCMSP、化源网、PubChem数据库检索，获得白竭散中部分化合物的分子式，导入“SwissTargetPrediction”，获得对应化合物的结构式，对于其他无法直接获得化学分子式及结构式的化合物，通过文献[4-5]查阅出该类化合物的化学结构式，使用“King Draw V1.2.2”绘制出对应的化学结构式，将所有获取的化合物化学结构式导入“SwissADME”，研究物种选择“人类”，以可能性≥0.12，将筛选完的成分进行靶点预测，获得115个化合物，500个基因靶点，基于数据库“Uniprot”，进行人类基因的名称转换、规范。

2.3 UC疾病靶点检索与筛选 基于OMIM、TTD、GeneCard、PharmGK、Drugbank、UniProt、Disgenet数据库，输入“Ulcerative Colitis”检索，检索范围为“智人”获得人类UC基因，与靶点取交集，构建“白竭散-UC靶点Venn图”，获得105个交集靶点(见图2)，获得白竭散对应有效成分106个，见表2。

表2 白竭散有效成分

图2 白竭散-UC靶点Venn图

2.4 药物-有效成分-疾病靶点网络构建 将105个交集靶点与106个有效成分输入Cytoscape 3.7.2获得白竭散治疗UC潜在靶点，建立“药物-有效成分-疾病靶点”网络图(见图3)。可见白竭散中同一个活性成分可以作用于多个靶点，不同的活性成分也可作用于相同靶点，充分体现白竭散多成分、多靶点特征。

(BJ:白及，LXJ：龙血竭)图3 药物-有效成分-疾病靶点网络图

2.5 蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络构建 将交集靶点导入String，以置信度≥0.4，得到一个105个节点、1365条边、密度0.639的PPI网络图(见图4)。以degree由大到小排序，按照degree≥2倍中位数34为标准，得到核心靶点27个，主要有蛋白激酶B1(Akt1)、血管内皮生长因子A(VEGFA)、白细胞介素2(IL-2)、环氧合酶2(PTGS2)、原癌基因蛋白(JUN)、表皮生长因子受体(EGFR)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)、肿瘤坏死因子(TNF)等。

图4 核心靶点PPI网络图

2.6 基因本体生物过程(GOBP)富集分析 采用Metascape对交集靶点进行GOBP富集分析，据P值选取前20类生物过程作图5，可知其主要富集在炎性反应、活性氧代谢等方面。

图5 GOBP富集分析图

2.7 京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析 将交集靶点进行KEGG通路富集分析，以P值、富集程度、基因数及相关研究结果作为条件，得到癌症信号通路、磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B(PI3K-Akt)信号通路、晚期糖基化终末产物-晚期糖基化终末产物受体(AGE-RAGE)信号通路、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路、核转录因子κB(NF-κB)信号通路、Janus激酶-信号转导和转录激活因子(Jak-STAT)信号通路、TNF信号通路、Toll样受体 (TLR) 信号通路等25条与UC相关的信号通路(见表3)。KEGG富集分析、靶点-通路可视化，分别见图6、7。

图6 KEGG通路富集分析图

图7 靶点-通路图

表3 KEGG通路富集分析

3 讨论

UC为世界性难治性慢性疾病之一，发病率逐年上升[6]。中医药防治UC经验丰富，较现代医学有显著优势。白竭散对局部创面组织中炎症细胞有明显抑制作用，能减轻创面炎性反应[6]，增加羟脯氨酸(OHP)含量，提高肉芽组织中血管内皮生长因子(VEGF)的表达，促进创面愈合，减轻疼痛。本实验用白竭散对UC模型大鼠进行灌肠治疗，结果显示，白竭散治疗组大鼠DIA、CMDI评分均较模型组降低(P<0.05)，且与美沙拉秦治疗组比较差异无统计学意义(P>0.05)，结肠组织病理状况改善，证明白竭散可缓解UC模型大鼠的结肠黏膜损伤。

白及药用历史悠久，可收敛止血，消肿生肌，主要含联苄类、菲类、联菲类等化合物[7]。白及中黏液质在创面上覆盖形成薄膜，抑制纤溶酶，增加血小板Ⅲ因子活性，形成人工血栓而止血，成为机械屏障而抗菌，同时白及多糖可抗溃疡、抗氧化，在胃溃疡中可通过调控Jak-STAT通路相关蛋白及氨基末端激酶(JNK)、p38丝裂素活化蛋白激酶(p38MAPK)蛋白的表达减轻炎性反应，也可抑制PI3K、Akt 表达发挥止血作用[7-8]，此外还可增加各类氧化酶活性，有效抑制损伤肠道中TNF-α、NF-κBp65含量[9]。龙血竭可活血化瘀，止痛消肿，敛疮止血，现代药理研究证明其有抑制血栓形成、止血、抗炎镇痛、抗氧自由基、促进表皮修复等功效，还可改善血小板激活状态，下调TNF-α，减轻UC炎性反应，阻断溃疡发展[10]。黄酮类物质为其主要成分之一，镇痛活血功效较强，如剑叶龙血素通过阻断P物质的合成和释放来抗炎镇痛，龙血素A可降低血液黏度、纤维蛋白含量，改善血液流动，抑制血栓形成，这可能与PI3K-Akt信号通路有关；酚类物质其第二大类成分，有显著抗菌消炎功效。杨天睿等[11]证实龙血竭可抑制多种自由基产生，降低氧化应激损伤，保护心肌细胞。

UC可发生癌变，其相关结肠癌(CAC)发病率较散发性结肠癌高。VEGF在UC炎性组织中高表达，进而激活血小板形成微血栓，损伤肠黏膜微循环，加剧缺氧，形成利于CAC形成的微环境，同时可激活AGE-RAGE信号通路[12]，进而诱导氧化应激反应及MAPK、NF-κB等多个信号通路。MAPK信号通路能通过级联反应来调控UC中炎症因子。磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(PI3K-Akt-mTOR)信号通路可通过影响细胞生长，促进UC炎症及癌变进展；EGFR在UC中高表达，参与UC复发、癌变过程[13]；TNF-α可通过NF-κB信号通路诱导细胞凋亡参与免疫调节。

在UC进程中，炎性反应主要由NF-κB、Jak-STAT、MAPK、TLR等信号通路介导[14]。此外，PTGS2可调节细胞黏附性及凋亡。氨基末端激酶(C-jun)作为JUN家族中重要一员，其参与炎症细胞整个生成及分化过程，通过JUN蛋白的表达来实现其功能，有研究表明JUN在UC的发生、发展中起一定的作用[15]。MMP-9可提高炎症细胞穿透性，削弱结肠黏膜防御力；TNF受体阻断剂可有效抑制促炎因子引起的肠道损伤；Akt主要通过调控细胞因子、抑制炎性反应介导UC进程；IL-2在UC中过表达[16]，可通过Jak-STAT信号通路干预炎症进展[17]； TLR通过启动NF-κB刺激大量炎症因子释放[18]。此外还有辅助性T淋巴细胞1(Th1)和Th2细胞分化、炎症性肠病等信号通路均在UC进程中起重要作用。

UC的发病机制还与氧化应激有关[19-20]。肠道内有丰富的微生物群，对氧化应激较为敏感，生理状态下氧化与抗氧化处于相对平衡状态，在某些病理状态下致前者超过后者引起氧化应激反应，引发UC。故抑制炎性反应，提高活性氧代谢，抑制氧化应激反应成为治疗UC的重要方案。本研究基于网络药理学研究的结果显示，白竭散可通过白及多糖、黄酮类及酚类等成分，调控Akt1、VEGFA、IL-2、PTGS2、JUN、EGFR、MMP-9、TNF等蛋白表达，干预癌症信号通路、PI3K-Akt、AGE-RAGE、MAPK、NF-κB、Jak-STAT、TNF、TLR等信号通路，以抑制炎性反应、提高活性氧代谢、抑制氧化应激反应来缓解UC肠黏膜损伤，与上述理论不谋而合。

综上所述，白竭散灌肠可有效缓解UC大鼠肠黏膜损伤，其机制可能是通过白及多糖、黄酮类及酚类等成分调控相关基因和通路，抑制炎性反应和氧化应激反应,提高活性氧代谢,从而缓解UC肠黏膜损伤，体现了中药多成分、多靶点、多通路的作用特点。