郏县红牛FGF13基因拷贝数变异及其与生长性状关联性分析

蔡含芳，徐 瑶，许会芬，黄永震，李 明*，陈 宏*

(1. 陕西省动物遗传育种与繁殖重点实验室，西北农林科技大学动物科技学院，陕西 杨凌 712100；2. 河南农业大学动物科技学院，郑州 450046)

近年来，随着分子生物技术的发展，特别是全基因组高通量测序技术的发展，使得分子标记的研究进入了一个全新的阶段，2004年，Sebat等发现了拷贝数变异(copy number variation, CNV)的存在[1]。CNV指的是在基因组上1 kb到几Mb范围内片段的插入、缺失、重复等，不同于单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)，CNV的覆盖范围更广，遗传效应更大。Liu等也在牛的染色体上检测到了大量的CNV区域[2]。研究表明，CNV作为一种新的基因变异来源，可作为与繁殖、泌乳和生长等多种性状相关的分子标记[2]。

成纤维生长因子(fibroblast growth factor, FGF)家族有23个成员，在细胞增殖和分化、组织修复、损伤应答和神经系统的信号转导等生理过程中发挥重要作用[3-4]。其中，FGF13基因定位在X染色体上，是调节神经元极化和迁移的微管稳定蛋白，也可调节细胞电压门控钠通道的运输和功能[5]。相较于人和小鼠上的研究，牛FGF13基因功能研究甚少见报道。

郏县红牛是我国优良的黄牛品种之一，具有体格高大，肌肉丰满，耐粗饲，适应性强，肉质细嫩，遗传性稳定等特点，是我国肉牛业发展不可多得的优良肉牛品种[6]。前期重测序结果显示，牛FGF13基因序列上存在CNV位点。为此，本研究在郏县红牛群体中，检测了FGF13基因的CNV，并研究了其与生长发育的相关性，为进一步研究牛FGF13基因的功能和郏县红牛的遗传改良工作提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集与体尺测量

本研究所用的57份健康的成年郏县红牛血样，采于河南省郏县，血样与20 μg/mL终浓度的ACD抗凝剂混合均匀，用冰盒运回实验室，置于-80℃ 超低温冰箱长期保存。同时，测量和记录个体的体尺性状，包括体高、体长、十字部高、胸围、管围等数据。

参照Chen的方法[7]，利用酚-氯仿抽提的方法从血样中提取DNA，分光光度计测定浓度后，稀释至标准浓度20 ng/μL，-20 ℃保存备用。

1.2 方法

1.2.1 qPCR 根据NCBI上公布的牛FGF13基因(GenBank accession number: NW_020192292.1)的序列，找到发生CNV的DNA序列，以该序列为参考序列，利用Primer 5设计定量引物，以通用转录因子3(basic transcription factor 3, BTF3)基因为参考基因，引物的详细信息如表1所示。

表1 CNV检测引物信息

20 μL PCR反应体系为：2×SYBR Premix Ex Taq II 10 μL，上下游引物(10 pmol/L)各1 μL，DNA模板2 μL，灭菌双蒸水6 μL。采用“三步法”的PCR程序：95 ℃预变性30 s，95 ℃ 变性，5 s；60 ℃退火，5 s；68 ℃延伸，15 s；40个循环。

1.2.2 数据处理 相对拷贝数的计算参照Livak和Schmittgen的方法[8]。具体的计算公式为：2×2-ΔΔCt，其中，ΔΔCt=ΔCt(实验组)-ΔCt(参照组)，ΔCt(实验组) =Ct(实验组目的基因) -Ct(实验组内参基因)，ΔCt(参照组) =Ct(参照组目的基因) -Ct(参照组内参基因)。按照Gain(-ΔΔCt>0.5)，Normal(-0.5 ≤ -ΔΔCt<0.5)和Loss(-ΔΔCt≤0.5)，对每个个体的拷贝数类型进行分类。

利用数据分析软件SPSS 18.0，采用皮尔逊相关分析，分析FGF13基因的相对拷贝数与郏县红牛体尺性状之间的相关性。采用独立样本T检验，比较郏县红牛群体与对照组秦川牛的相对拷贝数高低。

2 结果与分析

图1 FGF13基因CNV的检测结果

2.1 FGF13基因CNV的检测

如图1所示，FGF13基因的相对拷贝数在郏县红牛群体中，显著高于对照组秦川牛(P<0.05)，郏县红牛的相对拷贝数约是秦川牛的3倍。在郏县红牛中，FGF13基因的拷贝数类型有三种，拷贝数增加Gain(n=41)、拷贝数正常Normal(n=26)和拷贝数减少Loss(n=1)，三种类型的频率分别为71.39%，26.32%和1.75%。

2.2 关联分析

利用皮尔逊相关分析，进行郏县红牛生长性状与FGF13基因相对拷贝数之间的关联分析。结果表明，FGF13基因的相对拷贝数与郏县红牛的体高、十字部高、胸围、腹围和管围并无显著的相关性(图表未列出)，只与体斜长呈显著的正相关(P<0.05)，如图2所示，即郏县红牛的体斜长随着FGF13基因拷贝数的增加而增加。

图2 FGF13基因相对拷贝数与郏县红牛体斜长的关联分析

3 讨论

随着生物学突飞猛进的发展，分子标记辅助选择育种技术应运而生，即利用分子标记对动物进行遗传育种与改良。在我国肉牛的育种工作中，分子标记辅助选择主要是针对肉牛生长发育和牛肉品质相关的经济性状来开展。多年以来，基于SNPs开展的肉牛分子标记选择育种工作已取得了很多成绩，而近十年，随着CNV的发现，越来越多的学者开始关注其作为分子标记应用于肉牛育种工作的研究。不同于SNPs，CNV具有更广的遗传效应，它可通过剂量效应、位置效应、基因功能阻断或融合等诸多机制对基因的表达与功能进行调节，进而影响动物表型。Seroussi等发现，牛CNV区域456与牛肉的蛋白含量和脂肪含量紧密相关[9]，Liu等和Zhang等发现众多CNV位点与牛体重和大理石花纹性状相关的数量性状位点重叠[2,10]。Xu等发现牛MICAL-L2基因的拷贝数变异可通过剂量效应影响基因的表达，进而与中国黄牛的生长性状显著相关[11]。类似的，本文发现的拷贝数变异位点与郏县红牛的体尺性状显著相关，可作为郏县红牛选择育种的分子标记之一。

FGF13基因是重要的生长因子之一，在哺乳动物的多个组织中表达，在胚胎神经组织中高表达[12]。小鼠腿肌中FGF13基因的表达量显著高于眼外肌[13]。Lu等在小鼠成肌细胞中，研究发现FGF13基因可抑制成肌细胞分化[14]，进而影响肌肉的生长发育，由此可见，FGF13基因与机体的生长发育息息相关。众多研究表明，肌肉生长发育相关基因的序列上的分子标记，包括SNPs和CNV，均可作为肉牛生长性状选育的分子标记，如MYF5基因、LEPR基因和MICAL-L2基因等[11,15-16]。因此，本研究发现的FGF13基因上的遗传变异位点可作为生长发育相关的分子标记，应用于肉牛的遗传改良当中。

综上所述，本研究利用qPCR技术，在郏县红牛群体中检测FGF13基因的CNV，关联分析结果表明，该位点是与郏县红牛的生长性状显著相关的分子标记。本研究为加快郏县红牛的遗传改良和促进中国肉牛业发展提供了理论依据。