SEC11基因的HIGS表达载体构建及转基因水稻的抗病性分析

唐 喆，王光辉

(西北农林科技大学植物保护学院，陕西 杨凌 712100)

【研究意义】稻瘟菌 (Magnaportheoryzae) 是一种重要的植物病原真菌，也是研究植物-病原真菌互作的模式生物之一[1]。由稻瘟菌引起的稻瘟病是水稻上危害最严重的病害之一，其每年导致水稻产量损失达10%～30%，造成超过700亿美元的经济损失，严重威胁世界粮食安全[2-3]。因此，稻瘟病的防控已成为水稻生产中的重要内容。目前，在水稻生产中稻瘟病的防控主要依赖于施用化学药剂和种植抗稻瘟病水稻品种。但是化学农药防治费用较高，且容易造成抗药性和环境污染等问题。而稻瘟菌群体易发生变异的特点，致使新的抗病品种在推广3～5年后容易丢失抗性。稻瘟病菌基因组测序工作已于2005年完成并公布[4]，通过生物信息学分析在稻瘟菌基因组中预测到12 841个基因，这极大地推动了稻瘟菌遗传学和功能基因组学的研究。目前，已鉴定出一大批参与稻瘟菌生长发育和致病过程的关键基因，这为新型绿色杀菌剂的研发和新型抗病分子育种提供了新的作用靶标。【前人研究进展】研究表明，小片段RNA在细胞内能够引发RNA干扰现象，进而导致靶基因的沉默[5-6]。近年来，科学家利用RNA干扰原理发展出了寄主诱导的基因沉默(HIGS)技术，通过在植物细胞中产生小干扰RNA(siRNA)进而靶向并沉默病原菌的关键基因，目前该技术已在植物与病原菌的互作研究中被广泛应用[7-9]。在植物细胞内表达靶向病原菌关键基因的dsRNA，其经植物细胞Dicer蛋白切割后会产生相应的siRNA。当病原菌侵染寄主植物时，植物寄主能将siRNA转入病原菌细胞内使其与靶基因的mRNA结合，并将后者进行特异性的降解，从而干扰病原菌靶基因的转录和翻译。HIGS技术不仅可以作为一种反向遗传学手段用于研究病原菌关键基因的生物学功能，也可以作为一种新型的抗病育种策略以提高植物对特定病害的抗性。目前，HIGS技术已在小麦、大麦、水稻、棉花等多种作物的抗病分子育种中得到应用[10-14]。信号肽(Signal Peptide)是分泌蛋白或膜蛋白新生多肽链合成过程中位于N末端的一段氨基酸序列，其指导新生蛋白定位于内质网[15-16]。当新生蛋白进入内质网腔后，N端信号肽会被信号肽酶(Signal Peptidase)水解去除，随后新生蛋白再经过折叠等一系列加工过程形成成熟的蛋白[17]。信号肽酶是一类蛋白酶家族，广泛存在于生物体中，其通过由多个蛋白亚基组成的信号肽酶复合物(Signal Peptidase Complex，SPC)来发挥功能。在酿酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)中，信号肽酶复合物由四个亚基组成，其中仅有SEC11对细胞生长、信号肽切割和信号肽酶依赖的蛋白质降解具有重要作用[18-19]。SEC11基因编码信号肽酶复合物的催化亚基，其介导了分泌蛋白N端信号肽的切除[20]。另外，SEC家族蛋白的其它成员在信号肽酶复合物形成过程中发挥重要功能，其在调控病原菌致病过程中也扮演了重要角色[21-24]。例如，在新型隐球菌(Cryptococcusneoformans)中，SEC6基因的RNAi突变株中多种毒力因子存在缺陷，对小白鼠的毒力明显降低[25]。【本研究切入点】选取稻瘟菌SEC11为靶基因，成功构建了SEC11基因的HIGS载体。利用农杆菌介导的转基因技术将SEC11基因的HIGS载体导入水稻品种日本晴中，检测到转基因水稻植株对稻瘟病菌的抗性水平显著升高。【拟解决的关键问题】本研究不但创制了新的抗稻瘟病的水稻材料，也为利用HIGS技术作为新的抗稻瘟病分子育种策略提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

大肠杆菌DH5α，农杆菌AGL1，质粒pDONR221(Kan+)，质粒pBDL03(中国农业科学院刘文德研究员惠赠)，稻瘟菌70-15，水稻日本晴(本实验室保存)。TRIzol®Reagent，Gateway®BPClonaseTMIIEnzymeMix，Gateway®LRClonaseTMIIEnzymeMix购于Invitrogen公司。内切酶(EcoR V、KpnI、SacI)购于NEB公司。dNTP和TaqDNA聚合酶购于Fermentas公司。氨苄青霉素(Ampicillin，Amp)，卡那霉素(Kanamycin，Kan)，潮霉素(HygromycinB，Hyg)和利福平(Rifampicin，Rif)购于Roche公司。质粒提取试剂盒、凝胶回收试剂盒和RNA反转录试剂盒购于天根生物公司，其他化学试剂为国产化学纯，引物合成和质粒测序均由擎科生物技术有限公司完成。

1.2 RNAi干扰序列的选择与引物设计

在稻瘟菌基因组数据库(http://fungi.ensembl.org/Magnaporthe_oryzae/Info/Index)中，查询并下载SEC11基因(MGG_00114)的CDS(codingsequence)序列。利用BLOCK-iTTMRNAiDesigner在线工具(https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/design.do)查找SEC11基因中最佳的干扰序列，该序列不包含EcoR V、SacI和KpnI的酶切位点。利用Primer 6.0设计干扰区段的特异引物SEC11-F和SEC11-R，在两条引物的5′端分别加上Gateway的接头序列(下划线所示)。引物设计结果如下：SEC11-F：5′-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACAGCACCTCGCCCAAGA-3′；SEC11-R：5′-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGC TGGGTCAGCCACCAAACTCCACATCC-3′。根据潮霉素抗性基因，设计检测引物，如下：F1: 5′-TTCCTCCCTTTATTTCAGATTCAA-3′；R1:5′-GTATTGAC CGATTCCTTGCGGTCCGAA-3′。

1.3 RNA提取与目标干扰片段的获得

用TRIzol试剂(按照试剂提供的操作说明)提取稻瘟菌70-15菌株的总RNA，随后将稻瘟菌RNA通过反转录试剂盒合成cDNA。以稻瘟菌cDNA为模板，以SEC11-F和SEC11-R为引物，利用PCR技术扩增SEC11基因的RNAi干扰片段。将获得的PCR产物用2%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，验证其条带大小正确后，使用DNA凝胶回收试剂盒将目的DNA条带进行回收，并测定其浓度。

PCR扩增体系采用50 μL体系：1 μL cDNA(50 μg/μL)，SEC11-F(10 μmol/L)和SEC11-R(10 μmol/L)各2 μL，2 μL dNTPs(2.5 mmol/L)，0.6 μL DNA polymerase(500 U/μL)，5 μL 10 PCR buffer(含MgCl2)和36.4 μL ddH2O。扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 30 s，进行35个循环；72 ℃延伸10 min。

1.4 HIGS表达载体的构建

利用GatewayBP试剂盒构建入门载体pDONR221-SEC11(图1)。按照试剂盒说明书，将胶回收的PCR产物与载体pDONR221在BP缓冲液中进行重组反应。将BP反应后得到的产物用无菌水稀释4倍后取1 μL，采用电击转化法转入大肠杆菌DH5α的感受态细胞。将转化菌液涂布于含有卡那霉素的LB筛选平板(50 mg/L Kan)上，37 ℃培养过夜。挑取筛选平板上的单克隆菌落，在LB培养基(50 mg/L Kan))中37 ℃过夜摇培，然后提取质粒pDONR221-SEC11。提取的质粒用引物SEC11-F和SEC11-R进行PCR检测，以确定阳性克隆。将阳性克隆质粒送擎科生物技术有限公司进行测序，保证插入SEC11基因干扰片段的正确性。

将测序正确的入门载体pDONR221-SEC11，利用EcoR V内切酶进行线性化，随后用GatewayLR反应试剂盒构建HIGS表达载体(图2)。参照试剂盒说明书，将线性化的入门载体pDONR221-SEC11和pBDL03载体在LR反应体系中进行同源重组。重组后获得的反应产物用无菌水稀释4倍后取1 μL，进行电击转化，操作步骤同上，最终获得质粒pBDL03-SEC11。在质粒上的GUSlinker处设计测序引物，GUSLR1：5′-GACCAAAGCCAGTAAAGTAGAAC G-3′，GUSLF2：5′-CGTCGGTGAACAGGTATGGAA-3′，分别测出Gus linker两侧插入的靶标序列。如测序结果显示Guslinker两侧分别插入一个SEC11基因的干扰片段，形成方向相反的串联重复，则表示成功获得HIGS表达载体pBDL03-SEC11。

1.5 转基因植株的获得与鉴定

首先利用电转化法，将HIGS载体pBDL03-SEC11转入农杆菌AGL1感受态细胞，通过LB平板(50 mg/L Kan，50 mg/L Rif)筛选获得含有HIGS载体的农杆菌菌株。参照Hiei等人的方法[26-27]进行水稻日本晴的转化：将水稻成熟的愈伤组织与含有HIGS载体的农杆菌进行共培养，在水稻愈伤组织生长培养基(50 mg/L Amp，50 mg/L Hyg)上进行2～3次筛选，得到含有潮霉素抗性的水稻愈伤组织，经过愈伤组织分化与再生，得到T0代转基因水稻株系。在HIGS载体pBDL03-SEC11上带有编码mCherry红色荧光蛋白的基因，因而可以在植物活体成像仪下观察转基因植株中mCherry红色荧光蛋的表达情况[28-29]。利用PCR技术检测转基因植株中潮霉素抗性基因和RNAi干扰片段是否存在，最终明确含有HIGS载体pBDL03-SEC11的转基因水稻植株。

1.6 转基因水稻植株抗病性分析

收获T0代转基因水稻植株的种子后，选取5株转基因水稻的种子在温室条件下进行种植获得T1代转基因植株(各种植4株)。采用喷雾法对转基因水稻进行稻瘟菌分生孢子接种[30]。收集稻瘟菌野生型菌株70-15的分生孢子，用2.5‰的明胶溶液制备成孢子悬浮液(浓度为1×105个/mL)，用50 mL喷雾器将分生孢子悬浮液均匀地喷到3叶期的水稻(包括水稻野生型和转基因植株)叶片表面。在保湿箱中25 ℃避光保湿2 d，再转移至28 ℃光照条件下进行培养。接种7 d后，对各组水稻叶片上的稻瘟菌病斑进行观察统计和抗病性分析，明确含有HIGS载体pBDL03-SEC11的转基因水稻植株的抗病性。

图1 pDONR221载体与SEC11基因干扰片段构建入门载体pDONR221-SEC11示意图Fig.1 Diagram showing the construction of pDONR221-SEC11 by the recombination of pDONR221 plasmid and rice blast SEC11 gene fragment

图2 HIGS表达载体pBDL03-SCE11构建示意图Fig.2 Diagram showing the construction of HIGS expression vector pBDL03-SEC11

2 结果与分析

2.1 SEC11基因干扰片段的获得

在稻瘟菌基因组数据库中下载SEC11的CDS序列，利用RNAiDesigner工具寻找最优的RNAi干扰片段。通过Primer 6.0软件设计引物SEC11-F和SEC11-R。以稻瘟菌70-15的cDNA为模板，用引物SEC11-F和SEC11-R，扩增获得SEC11基因的特异干扰片段。用2%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，如图3所示，SEC11基因干扰片段大小为348 bp。

2.2 入门载体pDONR221-SEC11的构建及鉴定

将SEC11基因的最优RNAi干扰片段与入门载体pDONR221进行BP重组反应。SEC11基因干扰片段会将载体pDONR221上的ccdB基因通过同源重组进行替换，从而获得入门载体pDONR221-SEC11。在pDONR221载体上含有ccdB基因，而该基因产生的ccdB毒性蛋白可导致大肠杆菌DH5α的死亡，因而含有未重组pDONR221载体的阴性克隆不能生长。在筛选平板上随机选择4个单克隆菌株，摇培扩繁后提取质粒。以SEC11-F和SEC11-R为引物，用PCR对pDONR221-SEC11质粒进行检测，结果可以检测到阳性克隆中含有348 bp的SEC11基因干扰片段。将PCR检测为阳性的质粒pDONR221-SEC11，送往擎科生物技术有限公司进行测序，结果显示插入的SEC11干扰片段完全正确(图4)，表明SEC11基因干扰片段成功连接到入门载体pDONR221上。

M: DNAMarker DS2000；1: SEC11基因干扰片段 M: DNAMarker DS2000; 1: The fragment of SEC11gene图3 稻瘟菌基因SEC11片段检测Fig.3 Agarose electrophoresis of SEC11 fragment from rice blast fungus

图4 构建的质粒pDONR221-SEC11与SEC11基因序列的比对Fig.4 Sequencing result of vector pDONR221-SEC11alignment with SEC11gene

2.3 HIGS表达载体pBDL03-SEC11的构建及鉴定

将线性化的入门载体pDONR221-SEC11与pBDL03载体进行LR 重组反应，入门载体上的SEC11干扰片段会通过同源重组机制分别插入到pBDL03载体上Guslinker的两侧，形成反向重复序列。将得到的重组HIGS表达载体pBDL03-SEC11经SacI和KpnI双酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳可检测到10和2 kb左右的两条电泳条带。将双酶切鉴定正确的HIGS质粒pBDL03-SEC11送擎科生物技术有限公司进行测序，获得测序正确的阳性质粒。

2.4 转基因水稻植株的获得与鉴定

将测序正确的HIGS表达载体pBDL03-SEC11通过电击转化法导入农杆菌AGL1菌株中，经过PCR检测获得含有HIGS载体的农杆菌阳性菌株。采用农杆菌介导的转基因方法，将HIGS载体pBDL03-SEC11转入水稻日本晴品种中，获得28株含有HIGS表达载体的转基因水稻T0代植株。T0代转基因水稻经过种植后收获种子，选取其中5株T0代转基因水稻的种子进行种植得到T1代转基因水稻植株(每个转基因水稻分别种植4株)。为了验证T1代转基因水稻中是否含有HIGS表达载体，提取了T1代转基因水稻叶片的基因组DNA，使用潮霉素抗性基因和SEC11基因干扰片段的特异引物进行PCR检测。结果显示，在5个转基因水稻中均可以检测到特异的潮霉素抗性基因片段(图5)和SEC11基因干扰片段(图6)，而野生型水稻日本晴植株中检测不到这两个条带。在阳性转基因水稻植株中，潮霉素抗性基因扩增条带大小为487 bp，SEC11基因干扰片段大小为348 bp，与预测结果一致，表明检测的5株转基因水稻中均含有HIGS表达载体pBDL03-SEC11。

2.5 HIGS转基因植株的抗病性分析

将野生型水稻日本晴及T1代阳性转基因水稻植株培养至3叶期，用喷雾法接种浓度为1×105个/mL的稻瘟菌70-15菌株的分生孢子，接种7 d后统计发病情况(5个转基因水稻每个种植4株，3次生物学重复)。如图7所示，与野生型水稻日本晴相比，5株SEC11基因的HIGS转基因水稻叶片上的总病斑和大病斑数量都明显减少。以Hayashi等[31]提出的稻瘟菌单基因抗病性评价标准为参考，对野生型水稻和转基因植株上的稻瘟菌病斑数进行了统计分析，结果显示以稻瘟菌SEC11基因为靶标的5株HIGS转基因水稻叶片上的病斑数较野生型水稻日本晴减少了12%～60%(图8)，不同转基因株系之间的抗病性存在不同程度的差异。综上所述，靶向稻瘟菌SEC11基因的HIGS转基因水稻植株对稻瘟菌具有显著的抗病性。

3 讨 论

RNAi技术具有操作简单、周期短、成本低、效率高、特异性高等特点，已成为原生生物、动物和植物等生物功能基因组学研究的重要工具[32-35]。近年来，基于RNAi干扰原理发展起来的HIGS技术发展迅猛，其不但成为病原真菌与植物互作研究领域中的重要研究手段，也在一些植物的抗病实践中取得了显著成果。HIGS技术作为一种新兴的抗病育种策略，已成功运用到小麦[10-12]、水稻[13]和棉花[14]等重要经济作物的抗病研究和生产实践中。HIGS转基因植物可以产生以病原菌关键基因为靶标的dsRNA，dsRNA被细胞内的Dicer酶识别，切割成为21～25 nt大小的siRNA。当病原菌侵染寄主时，转基因植物能够将siRNA转移至病原菌细胞中，特异的识别病原菌的靶基因mRNA并将其降解，从而抑制病原菌的生长和致病过程。HIGS技术可以显著提高寄主植物的抗病性，表明在受到病原菌侵染时转基因植物产生的siRNA可以转移至病原菌中并沉默相应的靶基因。然而，这些siRNA分子通过何种途径和分子机制进入到病原菌细胞内的，尚不清楚。

M: DS2000DNAMarker；1～5：转化pBDL03-SEC11的水稻阳性植株；WT: 野生型水稻日本晴 M: DS2000DNAMarker; 1-5: Transgenic plant carrying BDL03-SEC11; WT: Wild-type rice cultivar Nipponbare图5 转基因水稻潮霉素片段PCR检测Fig.5 PCR detection of HYG fragment in transgenic rice plants

1～5: 转化pBDL03-SEC11的阳性植株；M: DS2000DNA Marker；WT: 野生型水稻日本晴 1-5: Transgenic plant carrying pBDL03-SEC11; M: DS2000 DNA Marker; WT: Wild-type rice cultivar Nipponbare图6 转基因水稻SEC11基因片段PCR检测Fig.6 PCR detection of SEC11 fragment in transgenic rice plants

4 结 论

本研究利用Gateway基因重组技术，成功构建了稻瘟菌SEC11基因的HIGS表达载体。Gateway基因重组技术的应用，使得HIGS载体的构建过程更加的快捷方便，只需两次体外同源重组反应即可获得最终的HIGS载体。尤其是在pBDL03载体上存在两个方向相反的attR同源重组位点，因而通过一次同源重组反应就可以将两个SEC11干扰片段分别插入到这两个attR位点上，最终得到由GUSlinker连接的两个方向相反的SEC11干扰片段。这两个反向串联重复的SEC11干扰片段可以被UBi启动子转录出相应的RNA并形成发卡结构，从而产生dsRNA。另外，在pDONR221和pBDL03载体上都含有ccdB基因作为负筛选标记，ccdB基因编码的毒性蛋白对于DH5α大肠杆菌是致死的，因而未发生正确同源重组的阴性克隆不能存活，从而显著地提高筛选平板上阳性克隆的比例。

WT: 野生型水稻日本晴；1～5: 转基因水稻 WT: Wild-type rice cultivar Nipponbare; 1-5: Transgenic rice carrying pBDL03-SEC11图7 稻瘟菌70-15在野生型和HIGS转基因水稻上的发病情况Fig.7 Disease symptom developed on the wild type and transgenic rice inoculated by Magnaporthe oryzae strain 70-15

WT: 野生型水稻日本晴；1～5: 转基因水稻*,P<0.05,**,P<0.01，单边t检验 WT: Wild type rice; 1-5: Transgenic rice carrying pBDL03-SEC11,*,P<0.05,**,P<0.01，t test图8 野生型和转基因水稻叶片上相对病斑数Fig.8 Relative number of lesion spots on leaves of the wild type and transgenic rice

由于水稻大部分基因与稻瘟菌的基因序列不存在同源性，因而HIGS转基因植物产生的siRNA一般不会对水稻本身造成危害，表明HIGS技术在水稻抗病分子育种方面具有巨大的应用潜力。本研究结果显示，以稻瘟菌SEC11为靶标的HIGS转基因水稻与野生型水稻相比，总病斑数和病斑大小都显著降低，表明该HIGS转基因水稻对到稻瘟菌具有显著的抗病性。然而，相比于HIGS技术在抗小麦白粉菌[10]、黄色镰刀菌[7]、条锈菌[11-12]和灰霉菌[36]应用的研究，本研究获得的转基因水稻的抗性水平仍需要进一步提高。据报道，不同HIGS表达系统的转基因植物的沉默效果也不尽相同，甚至有HIGS载体随机插入到寄主的关键性基因中[37]，导致寄主植株出现严重的表型缺陷。如何安全有效的选择靶标基因干扰片段，以及如何构建稳定的且不影响植物表型的HIGS表达系统，对于研究植物与真菌互作关系以及获得稳定安全的转基因抗病植物都具有重要的指导意义。未来的不断尝试和探索将会推动HIGS技术的不断发展和更新，这些问题也将会得到更好的解决，使得HIGS技术在抗病作物分子育种方面具有更广阔的发展空间和应用前景[38]。