碱蓬内生菌EF0801对感染稻瘟病水稻幼苗抗氧化酶及叶绿素荧光的影响

单 羽，任晓宁，姚禹希，李 鑫，李雪梅

(沈阳师范大学生命科学学院，辽宁 沈阳 110034)

【研究意义】稻瘟病是由稻瘟病菌(Magnaporthegrisea)引起的水稻真菌性病害，是最具毁灭性的水稻病害之一，该病可在短时间大面积爆发，使其严重减产，甚至绝收[1]。全球每年由稻瘟病引起的水稻产量损失约为总量的10%～30%，它可以养活至少6000万人，经济价值高达660亿美元[2]。因此对于稻瘟病的防治也是重中之重，通过碱蓬内生菌EF0801侵染水稻，研究内生菌侵染是否能够诱导水稻增强对稻瘟病菌的抵抗能力具有重要意义。【前人研究进展】水稻在受到稻瘟病菌感染时，其叶绿素含量逐渐降低[3]。叶绿素荧光作为一种非侵入性且非破坏性的方法，可以更好地了解病原体感染过程中光合作用的变化。在宿主-病原体互作过程中，小麦[4-5]、水稻[6]、玉米[7]、大豆[8]的叶绿素荧光参数会发生变化。通常，病原体感染的植物叶片有效PSII量子效率下降，受调节能量耗散的量子产量的增加以及最大PSII量子产量的下降[9]。另外，植物在正常状态下由于防御酶(如SOD、CAT和POD)等活性氧清除系统的存在而使体内活性氧处于动态平衡[10]。当植物处于胁迫条件下(如病原体感染)会使活性氧增加[11-12]。因此，有效的清除活性氧，可以避免由于膜脂过氧化和破坏大分子对植物细胞产生不可逆的氧化损伤。Eberhard等[13]研究发现在接种稻瘟病后，水稻叶片POD活性快速上升，POD活性与抗瘟性呈正相关，活性增强有利于水稻对稻瘟病的抗性。【本研究切入点】近年来，内生菌的研究成为了国内外研究的热点。植物内生菌是指全部阶段或部分阶段生活在健康的植物细胞内或细胞间隙的微生物资源[14]。越来越多的数据表明，内生真菌会增加宿主植物对生物和非生物胁迫的耐受性[15-17]。Shabanamol等[18]从水稻中分离出一株内生固氮芽孢杆菌(Lysinibacillussphaericus)，可以诱导水稻产生更多的防御酶，减轻纹枯病的危害。深色有隔内生真菌(DSE)可以通过降低水稻植株中氧化应激反应和抗氧化酶的活性从而保护水稻细胞免受氧化损害，进而增强水稻在缺水条件下的耐受性[19]。研究碱蓬内生菌(EF0801)与水稻互作关系及作用机理具有重要意义。【拟解决的关键问题】本研究采用5%的碱蓬内生菌(EF0801)菌悬液对未感染及感染稻瘟病菌的水稻进行处理。测定其处理7 d后的形态指标、叶绿素含量、叶绿素荧光参数及抗氧化酶活性的变化。探讨内生菌侵染是否能够诱导水稻对稻瘟病菌的抵抗能力，以期为提高水稻稻瘟病抗性提供一种新的方法。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试水稻(OryzasativaL.)品种为辽星1号。将精选的水稻种子置于恒温培养箱内，黑暗下28 ℃浸种24 h后30 ℃催芽24 h。将露白种子均匀地铺满盛有完全营养液(Hoagland)的烧杯(覆盖纱网)上进行水培。在人工气候培养箱(昼夜温度28 ℃/26 ℃；光照16 h；80%相对湿度；光强3000 lx)培养，每天适时适量的补充Hoagland完全营养液。待水稻幼苗长至2叶1心期进行处理。

碱蓬内生菌EF0801为沈阳师范大学微生物教研室筛选获得。将EF0801菌株转接到PDA液体培养基中，在恒温摇床上120 r/min，24 ℃培养10 d。用搅拌机将菌球打碎，菌悬液备用。

稻瘟病病菌由沈阳农业大学提供。参照李元等[28]的方法，将稻瘟病菌菌丝移至产孢培养基，在26 ℃、10 h/d光照培养8～10 d，将孢子悬浮液浓度调至约3×105(孢子)/mL作为苗期喷雾接种体。

1.2 处理方法

选取长势相同的2叶1心期水稻幼苗分为4组进行处理。对照组(CK)：整个实验期间均使用完全营养液进行培养；内生菌侵染组(E)：将5%的碱蓬内生菌EF0801菌悬液加入到完全营养液中进行培养；稻瘟病病菌感染组(RB)：将稻瘟病菌孢子液喷洒至水稻幼苗叶片上，直到刚好有水珠为止；稻瘟病和内生菌处理组(RB+E)：将5%的碱蓬内生菌EF0801菌悬液加入到完全营养液中进行培养，在第2 天将稻瘟病菌孢子液喷洒至水稻幼苗叶片上。处理7 d后，测定水稻的相关指标，每个处理重复3次。

1.3 测定指标

1.3.1 形态指标的测定 选取10株幼苗，分别测定株高、根长、鲜重和干重。

1.3.2 叶绿素含量、防御酶活性以及丙二醛(MDA)含量的测定 参照李小方和张志良[22]的方法并加以改良，测定Chla、Chlb、类胡萝卜素(Cars)含量、防御酶SOD、POD和CAT活性以及MDA含量。

1.3.3 叶绿素荧光参数的测定 选择长势相同的幼苗，使用连续激发式荧光仪Pocket PEA测定。测定时间为10:00—14:00，测定前对叶片进行暗处理20 min。在OJIP曲线测定中，诱导光强度设为3000 μmol/(m2·s)脉冲红光，从10 μs开始记录相对荧光强度，其中OJIP曲线上0.02、2、30和1000 μs对应的点分别为O、J、I、P，最后利用平均值绘制OJIP曲线，本实验主要研究不同处理条件下，K点和L点的相对荧光强度以及相关参数的变化。

1.4 数据处理

数据处理采用SPSS 25.0软件，通过平均值和方差分析(ANOVA)和LSD检测，比较其差异显著性。

2 结果与分析

2.1 内生菌侵染对感染稻瘟病菌水稻幼苗生长的影响

株高和根长可直接反映出植物的生长情况，同时生物量也是反映植物生长的一个非常有效的指标。由图1可知，经过E处理的水稻幼苗株高、鲜重和干重显著高于CK组。经过RB处理的水稻幼苗与CK组相比较，根长及鲜重有显著性升高，但株高和干重无变化。而经过RB+E复合处理与RB处理相比株高和干重显著升高。

2.2 内生菌侵染对感染稻瘟病水稻幼苗叶绿素含量的影响

叶绿素是在光合作用中参与吸收、传递光能或引起原初光化学反应的色素，其含量直接影响植物的光合能力。经过E处理的水稻幼苗Chla含量显著增加(图2-A)。RB处理则显著降低Chlb含量(图2-B)。而RB+E处理与RB处理相比，Cars含量显著升高(图2-C)。

2.3 内生菌侵染对感染稻瘟病水稻幼苗荧光诱导动力学的影响

2.3.1 对水稻幼苗荧光动力曲线OJIP、ΔVOP、ΔVOK以及ΔVOJ的影响 叶绿素荧光诱导动力学曲线是绿色植物经过暗适应，突然暴露在强光下以后，植物产生的一条荧光曲线，通常产生O、J、I、P 4个特征点。荧光诱导(O-J-I-P)呈现典型的多相上升，表明所有叶片样品都具有光合特性(图3-A)。对O-P相的荧光参数进行标准化，经过RB处理的水稻幼苗其ΔVOP值大于零，而E和E+RB处理组其ΔVOP值小于零(图3-B)。同时对O点(50 μs)和K点(300 μs)及O点和J点(2 ms)的荧光数据进行动力学曲线绘图，经过RB处理的水稻幼苗ΔVOK、ΔVOJ值均大于零，而经过E和E+RB组处理的水稻幼苗其ΔVOK、ΔVOJ值均小于零(图3-B，3-C)。ΔVOP>0，说明放氧复合体的活性低；ΔVOK>0，说明类囊体之间的能量传递受阻，如果ΔVOK≤0，说明光合膜系统完整，能量传递顺畅；ΔVOJ越大，说明放氧复合体受到的伤害越严重。由此说明水稻叶片光合膜系统完整、能量传递、放氧复合体活性均优于RB组(图3-B、3-C、3-D)，碱蓬内生菌EF0801可以有效地减缓稻瘟病菌对水稻幼苗光PSⅡ的伤害。

2.3.2 对水稻幼苗性能指数的影响 与CK相比较，经过RB胁迫后，以单位面积为基础的性能指数(PI)有显著性的下降，而经过E和RB+E处理的有显著性的提高(图4-A)。与CK相比较，经过E处理的水稻幼苗叶片以光能吸收为基础的性能指数(PIABS)显著增加，而经过RB处理后则显著下降，经过E+RB处理后的有一定程度下降，但与RB相比较有显著性的增加(图4-B)。

2.3.3 对水稻幼苗量子效率的影响 不同处理后用于电子传递的量子产额(φEo)、用于热耗散的量子比率(φDo)和最大光化学效率(φPo)变化情况。经过E处理的水稻幼苗与CK组相比，φEo显著提高(图5-A)，而经过RB处理的水稻幼苗φEo和φPo显著降低(图5-A、5-C)，且其φDo与CK组相比显著提高；经过RB+E处理的水稻幼苗与RB组相比，其φEo和φPo显著提高，且φDo显著降低(图5-B)。表明内生菌侵染能够提高稻瘟病菌感染后用于电子传递的量子产额和最大光化学效率，降低用于热耗散的量子比率，提高光合效率。

2.3.4 对水稻幼苗比活性参数的影响 PSⅡ比活性参数包括单位反应中心吸收的光能(ABS/RC)、单位反应中心捕获的用于还原QA的能量(TRo/RC)以及单位反应中心耗散掉的能量(DIo/RC)。由图6显示，经过E处理的水稻幼苗与CK组相比ABS/RC和TRo/RC无显著变化，DIo/RC显著降低，而经过RB处理的水稻幼苗3种比活性参数均显著增加，但经过RB+E处理的水稻幼苗显著降低。

2.4 内生菌侵染对感染稻瘟病菌水稻幼苗叶片防御酶活性的影响

如图7所示，经过E处理的水稻幼苗中SOD、POD、CAT活性均显著升高，而经过RB处理均无显著性差异。将RB+E处理组与RB组进行对比，RB+E组中POD、CAT活性显著升高。

2.5 内生菌对感染稻瘟病水稻幼苗叶片MDA含量的影响

如图8所示，经过E处理的水稻幼苗MDA含量显著降低，RB处理的水稻幼苗无显著变化。经过RB+E处理的水稻幼苗MDA显著低于CK。内生菌侵染水稻幼苗对幼苗叶片膜质过氧化有一定的缓解作用。

3 讨 论

通过本研究发现，内生菌显著提高水稻的防御酶活性，可以有效降低水稻膜脂过氧化作用，减小细胞膜的损伤，提高Chla含量。

在本研究中，稻瘟病菌感染水稻虽未引起显著膜脂过氧化和防御酶活性的改变，但从荧光动力学方面可以看出，感染稻瘟病菌水稻的PSⅡ已经受到破坏，其ΔVOP、ΔVOK以及ΔVOJ的数值明显大于零，说明稻瘟病菌抑制了放氧复合体的活性，从而导致类囊体发生解离，抑制了PSⅡ的光化学活性。然而加入内生菌后感染稻瘟病菌的水稻幼苗ΔVOP、ΔVOK以及ΔVOJ的数值均下降，这可能是内生菌抑制了稻瘟病对PSⅡ的光化学活性的影响，使植物水稻光合作用正常进行。张兴华等[23]通过对叶绿素荧光诱导动力曲线分析认为干旱胁迫导致玉米光PSⅡ放氧复合体受到抑制。除此之外，被稻瘟病菌感染的水稻幼苗Chlb显著降低，但内生菌能够提高感染稻瘟病菌水稻的Chla和Cars含量。在龚娜等[24]研究中，也发现植物内生菌提取物拌种，会提高干旱胁迫下玉米苗期的叶绿素含量，增强光合能力。此外，PIABS可以准确反映植物光合机构的整体状态[25]。RB+E组的PIABS值显著高于RB组，说明内生菌处理可以提高水稻叶片对光能利用。用内生菌处理感染稻瘟病菌的幼苗，其φEo和φPo显著升高，而φDo显著下降，表明内生菌侵染能够提高稻瘟病菌感染后用于电子传递的量子产额和最大光化学效率，降低用于热耗散的量子比率，提高光合效率。RB+E组幼苗的ABS/RC、TRo/RC、DIo/RC均低于RB组。这些结果表明单位反应中心吸收的光能、捕获光能的能力增加，可能是由于一些RCs失活，并认为热耗散是由于非活动RCs的高耗散而增加[26]。

叶绿素荧光参数的变化可以作为探究植物的光合过程及一些环境因素对其影响的重要手段[27]。性能指数是JIP-test的参数中最敏感的参数之一[28]。稻瘟病菌感染的水稻幼苗，其性能指数、量子产额和最大光化学效率显著下降，比活性参数显著增加，说明稻瘟病菌已经影响PSⅡ的正常功能，而内生菌处理的水稻幼苗则能够维持PSⅡ稳定性，保持高效的PSⅡ功能。

4 结 论

内生菌侵染可以使水稻幼苗防御酶活性增强，降低MDA含量，使叶片放氧复合体稳定，电子传递正常进行，保持高效的PSⅡ功能，从而提高水稻对稻瘟病的抗性。