云南西双版纳地区橡胶树炭疽病菌的系统进化分析和室内药剂筛选

徐从英，王 萌，梁晓宇，马 腾，杨 叶，张 宇*

(1.海南大学化学工程与技术学院，海南 海口 570228；2.海南大学植物保护学院，海南 海口 570228； 3.天然橡胶省部共建协同创新中心，海南 海口 570228)

【研究意义】橡胶树(Heveabrasiliensis)因相较于其他产胶植物具有不可媲美的优越性，在亚非拉国家适宜地区广泛种植。我国橡胶树的种植主要分布在云南、海南、广东、广西等热带、亚热带地区[1]。其中云南因其光照充足、少寒害低温、昼夜温差大、无台风袭击等独特自然地理条件，已成为我国最好的天然橡胶基地[2]。2011年底，云南省橡胶种植面积首超海南省成为我国橡胶种植面积最大的省份，其中主要植胶区西双版纳的橡胶树干胶产量占云南省干胶总产量的72.73%[3]。由炭疽菌(Colletotrichumspp.)引起的炭疽病是橡胶树的重要叶部病害之一。该病菌可侵染橡胶树的叶、嫩梢和果实，严重时引起嫩叶脱落、嫩梢回枯、果实腐烂[4]。由于气候变化、病原菌适应环境性增强、橡胶树抗病性下降等因素，该病发生日趋频繁，严重影响胶乳产量[5-6]。而该病原菌的分类鉴定对橡胶树炭疽病防治具有重要意义。【前人研究进展】炭疽菌种类繁多，遗传多态性丰富，目前我国橡胶树炭疽病主要病原菌为胶孢炭疽菌复合群 (Colletotrichumgloeosporioidesspecies complex) 和尖孢炭疽菌复合群(Colletotrichumacutatumspecies complex)。其中胶孢炭疽复合群包括C.siamense、C.fructicola、C.ledongense等，尖孢炭疽复合群包括C.bannanense、C.australisinense、C.laticiphilum、C.wanningense等[7-8]。由于复合群中的不同种的生物学特性不同，使得橡胶树胶孢炭疽菌和尖孢炭疽菌复合群内在种群比例、分布范围、为害症状和为害程度等方面存在明显差异[9]。【本研究切入点】目前胶孢炭疽复合群下的C.siamense以及尖孢炭疽复合群下的C.wanningense为海南地区橡胶树炭疽菌的优势种[10]，云南地区橡胶树炭疽菌复合群的种属分类及优势种尚不明确。【拟解决的关键问题】本研究通过对云南西双版纳地区橡胶树炭疽病菌的系统进化分析和室内药剂筛选，明确云南主要植胶区的橡胶树炭疽菌复合群的种属分类及优势种，为橡胶树炭疽病病原检测和制定有效防治策略提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试药剂、培养基、菌株：98%咪鲜胺(Prochloraz)、96%苯醚甲环唑(Difenoconazole)、98%嘧菌酯(Azoxystrobin)、97.5%吡唑醚菌酯(Pyraclostrobin)原药购自海南正业中农高科股份有限公司，吡噻菌胺(Penthiopyrad)分析标准品购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。马铃薯葡萄糖琼脂培养基 (PDA)：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g，蒸馏水定容至1000 mL。本实验室提供的HN16菌株为在我国首次发现的橡胶树炭疽病菌C.cliviae菌株[11]。

供试试剂及仪器：DNA 提取试剂盒购自Omega公司，高保真PCR 扩增试剂盒及DNA Marker购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。BDS400倒置生物显微镜购自重庆奥体光学仪器有限公司，T100-PC PCR扩增仪购自美国伯乐公司。

1.2 试验方法

1.2.1 病原菌的采集和分离 橡胶树炭疽病病叶于2019年2月22—23日期间采集于云南省西双版纳地区景洪市东风农场(21.72°N,100.78°E)和勐腊县勐捧农场(21.41°N,101.38°E)。每个采集地选取20个发病植株，每株采集一个具有典型发病症状的叶片。在病健交界处切取5.0 mm ×5.0 mm大小的叶片，用75%酒精浸泡40～60 s，再用0.1%的升汞浸泡1～2 min后用无菌水漂洗3次，放在灭菌滤纸上晾干后置于PDA平板上。于28 ℃恒温培养箱中培养3～4 d，选取菌落边缘的菌丝继续纯化培养。

1.2.2 形态学鉴定 将纯化后的菌株接种在PDA平板上，28 ℃条件下培养5 d，观察菌落形态并测量直径，在显微镜下观察10个以上视野的分生孢子形态特征，每个视野观察20个孢子，根据炭疽菌分生孢子形态特征初步鉴定后[12]，单孢分离所得的菌株编号并于4 ℃冰箱中保存备用。

1.2.3 病原菌致病性测定 挑选健康的橡胶树变色期叶片用75%酒精表面消毒处理1 min，再用无菌水清洗3次，晾干备用。选取已产生橘色孢子堆的炭疽菌PDA平板，用无菌水洗下分生孢子，制成浓度为106个/mL的孢子悬浮液。取10 mL孢子悬浮液对叶片正面进行喷施接种。对照采用无菌水处理，设5个重复。将接种的橡胶树叶放置在带有湿润无菌滤纸的塑料盒中，在28 ℃、100%相对湿度的人工气候箱中培养直至发病症状出现，观察统计叶片发病情况。分离纯化发病叶片中的病原菌，与原接种菌株比较形态特征。

1.2.4 病原菌的分子生物学鉴定 通过DNA提取试剂盒提取橡胶树炭疽菌的基因组DNA。靶标基因为核糖体转录间隔(ITS)、肌动蛋白基因(ACT)、微管蛋白基因(TUB)、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)、几丁质合成酶基因(CHS-1)，引物序列与反应体系同文献[13]。扩增产物送广州天一辉远基因科技有限公司测序。测序所得序列分别与GenBank数据库中已知基因序列进行BLAST同源性检索，从GenBank数据库中下载与待测菌株相似度95%以上的部分炭疽菌菌株序列，采用邻接法运用MEGA 7.0软件构建系统发育树。

1.2.5 5种杀菌剂对橡胶树C.cliviae菌株的室内毒力测定 采用菌丝生长速率法测定供试橡胶树C.cliviae菌株对咪鲜胺、苯醚甲环唑、嘧菌酯、吡唑醚菌酯、吡噻菌胺的敏感性[12]。根据预备试验设计不同药剂系列浓度：0.01、0.05、0.1、0.5、1 mg/L(咪鲜胺)；0.1、0.5、1、2、5 mg/L(苯醚甲环唑)；0.1、0.5、1、5、10 mg/L(嘧菌酯 + 50 mg/L 水杨羟肟酸)；0.1、0.5、1、5、10 mg/L(吡唑醚菌酯 + 50 mg/L 水杨羟肟酸)；0.1、0.5、1、2、5 mg/L(吡噻菌胺)。在培养4 d的炭疽菌PDA平板打取菌碟，接种到含药平板，以含有等体积溶剂的平板为对照，每个处理重复3～5皿，试验重复2次， 28 ℃培养4 d后测量各处理的菌落直径，计算菌丝生长抑制率。利用DPS软件建立药剂浓度对数(x)与菌丝生长抑制机率值(y)之间的毒力回归方程y= ax+ b，计算有效抑制中浓度(EC50)及相关系数。

2 结果与分析

2.1 病原菌的分离及形态学鉴定

从云南西双版纳地区景洪市和勐腊县橡胶林采集的橡胶树炭疽病病叶各20份。经分离纯化获得菌丝形态特征疑似炭疽菌的菌株共37株，其中景洪市19株，编号为JH1至JH19，勐腊县18株，编号为M1至M18。37株菌株的菌落具有一致的形态特征，菌落棉絮状，菌丝初期呈白色，培养第5天时，菌落中间出现橘色孢子堆，产生分生孢子。由于JH3和JH5菌株未产孢，对其余35个菌株进行了分生孢子形态鉴定，分生孢子单胞，无色，内含1个或2个或多个油球，大小为(9.8～17.5)μm ×(2.9～4.8)μm，初步鉴定这35个菌株均属于炭疽菌Colletotrichum(图1)。其中23个菌株的分生孢子两端钝圆，12个菌株分生孢子一端尖锐，符合胶孢炭疽菌复合群和尖孢炭疽菌复合群的特征，具体种属有待于进一步分子鉴定。

2.2 病原菌的致病性检测

将35个菌株的分生孢子接种健康橡胶树叶片，36 h后即发病，接种症状与田间发病症状相似。分离纯化发病叶片中的菌株，发现其与原接种菌株具有相同的形态特征。根据柯赫氏法则，判定这35个菌株为橡胶树炭疽病的致病菌(图2)。

2.3 系统发育树分析

以上述35个菌株的基因组DNA为模板，扩增ITS、 ACT、TUB、GAPDH和CHS-1基因并测序。将测序所得序列经 NCBI 数据库序列对比后确定该35株菌株同属于炭疽菌属，比对结果与形态学鉴定结果一致。选取了包括已报道的橡胶树炭疽菌菌株在内的共31个菌株基因序列作为参考序列[8]，利用ITS、ACT、TUB、GAPDH、CHS-1五个基因的拼接序列，以邻接法构建系统发育树(图3)。结果表明，35株炭疽菌可分为4个种，分别为胶孢炭疽菌复合群下的C.siamense，尖孢炭疽菌复合群下的C.laticiphilum和C.wanningense，以及新种C.cliviae。这是C.cliviae在云南地区橡胶树炭疽病菌中的首次报道。测序菌株中有22株属于孢炭疽菌复合群，占比63%，且均为C.siamense菌株。有12株属于尖孢炭疽菌复合群，占比34%，其中4株为C.laticiphilum菌株，8株为C.wanningense菌株。

2.4 5种杀菌剂对橡胶树C.cliviae菌株的室内毒力测定

5种杀菌剂对橡胶树C.cliviae菌株的菌丝生长具有不同程度的抑制效果，EC50为0.075～1.090 mg/L(表1)。5种杀菌剂抑制效果大小依次为咪鲜胺、吡唑醚菌酯、嘧菌酯、苯醚甲环唑和吡噻菌胺。5种杀菌剂对海南HN16菌株和云南M3菌株抑制效果相当，EC50差值不超过0.08 mg/L。

3 讨 论

炭疽病是我国橡胶树的重要叶部病害之一，其病原物炭疽菌种类繁多，遗传多态性丰富，不同种间形态和保守基因序列差异小，给分类鉴定工作造成了很大困难。采用形态学鉴定和rDNA-ITS序列分析的方法对炭疽菌的鉴定仅局限于复合群水平，对复合群中种的鉴定能力不足[15-16]。多基因系统进化分析技术很好地解决了炭疽菌分类上的困难。Damm等基于TUB、GAPDH、CHS-1基因序列的进化分析方法成功地鉴定出尖孢复合群中的Colletotrichumlaticiphilum[17]。Hunupolagama等利用ITS、GAPDH、TUB基因序列的进化分析方法明确了斯里兰卡地区橡胶树尖孢炭疽菌复合群中的种类别[18]。Liu等采用ITS、ACT、TUB、GAPDH、CHS-1基因序列的进化分析方法对我国橡胶树胶孢炭疽菌和尖孢炭疽菌复合群下的种进行了鉴定和分类[8]。本研究采用形态学和多基因系统进化分析相结合的鉴定方法，阐明了我国云南西双版纳地区的橡胶树炭疽病菌的种属分类与优势种。

本研究成功鉴定出云南西双版纳地区35株橡胶树炭疽病菌，其中63%为胶孢炭疽菌复合群，34%为尖孢炭疽菌复合群。Cao等发现海南地区橡胶树炭疽病菌中有78%为胶孢炭疽菌复合群，22%为尖孢炭疽菌复合群[7]。由此可见，我国云南和海南地区的橡胶树炭疽病菌种群比例差异不大，优势种群均为胶孢炭疽菌复合群。此外，在云南西双版纳地区发现的胶孢炭疽菌复合群中的菌株均属于C.siamense，说明该病原菌是云南西双版纳地区橡胶树炭疽病菌的优势种，与此前报道的C.siamense为我国橡胶树胶孢炭疽菌复合群中的优势种相一致[8]。Shi等在我国云南地区首次发现了橡胶树炭疽病菌C.laticiphilum菌株[19]，本次鉴定的尖孢炭疽菌复合群中有4个菌株也属于C.laticiphilum。已有研究表明，C.laticiphilum是我国橡胶树尖孢炭疽复合群的主要种之一[8-9]。此前有报道在云南红河和德宏地区发现橡胶树炭疽病菌C.boninense[20]，在德宏地区发现橡胶树炭疽病菌发现C.karstii[21]，本研究未在西双版纳地区未发现这两种炭疽菌，可见其引起的炭疽病尚处于零星发生状态。另外，Cao等在我国海南地区首次发现了橡胶树尖孢炭疽菌复合群下的C.wanningense菌株[10]，本研究在云南地区橡胶树上同样发了8个C.wanningense菌株。由此可见，我国橡胶树炭疽菌种类地域性差异不大，但与斯里兰卡的橡胶树炭疽菌种类明显不同[18]，这可能与气候和种植品种不同有关，其地域分布差异性有待于进一步研究。近期本实验室在海南地区发现的HN16菌株是首次在我国报道的橡胶树C.cliviae[11]。本研究也成功分离出1个C.cliviae菌株M3，此为云南地区橡胶树C.cliviae的首次发现，这说明C.cliviae可能已在我国植胶区分布广泛。为了预防新种C.cliviae可能引起的橡胶树炭疽病危害，本研究测定了5种杀菌剂对橡胶树C.cliviae菌株M3和HN16的室内毒力。结果表明，麦角甾醇合成抑制剂类、甲氧基丙烯酸酯类、琥珀酸脱氢酶抑制剂类这三种杀菌剂对C.cliviae均有良好的菌丝生长抑制作用，EC50值不大于1.09 mg/L，其中咪鲜胺抑制效果最佳，EC50值为0.075～0.084 mg/L。咪鲜胺是我国防治橡胶树炭疽病的重要药剂之一。2017年的室内毒力测定结果表明，咪鲜胺对35株橡胶树胶孢炭疽菌和20株橡胶树尖孢炭疽菌的菌丝生长抑制EC50值均小于0.08 mg/L[7]。综上所述，咪鲜胺对我国橡胶树炭疽病菌的抑制活性依然良好，尚可继续用于橡胶树炭疽病的防治。

表1 5种杀菌剂对橡胶树C.cliviae菌株的毒力作用

4 结 论

本研究成功分离鉴定出云南西双版纳地区橡胶树炭疽病菌35株，其中63%的菌株属于胶孢炭疽菌复合群，34%的菌株属于尖孢炭疽菌复合群，优势种为胶孢炭疽菌复合群下的C.siamense。另外，咪鲜胺对我国新发现的橡胶树C.cliviae的抑制效果依然良好。