猪瘟野毒感染抗体阻断ELISA检测方法的建立与初步评价

周景云，刘百红，刘雪微，杨欣艳，李宝春，陈西钊

(北京世纪元亨动物防疫技术有限公司，北京 100094)

猪瘟是猪瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)引起的一种高度接触性传染病，具有高传染性和高致病性的特点，严重阻碍我国养猪业的发展[1]。猪瘟被世界动物卫生组织(OIE)列为通报疫病之一，我国将其列为一类动物传染病[2-3]。猪瘟的出现距今已有200多年，目前虽然很多国家已经消灭了猪瘟，但近期，日本26年来再次暴发该病[4-5]，因此它仍然是危害养猪业发展的重要传染病。目前对猪瘟的防控主要是疫苗免疫，但受各方面因素影响，猪瘟疫苗免疫失败现象时有发生，猪瘟在局部地区仍有发生与流行[6-7]。近年来，猪瘟的流行形式已从频发的大流行转变为多地区散发性流行，大多数表现为温和型猪瘟，临床症状减轻，呈现亚临床感染。母猪感染猪瘟，导致长期带毒、散毒，成为猪瘟预防免疫效果差、反复发生的重要原因。

CSFV属于黄病毒科瘟病毒属。该病毒基因组为单股正链RNA，基因组的中间部分是编码多聚蛋白的开放阅读框[8-9]，从 5′→3′依次编码的结构蛋白为 Npro、C、 E0、E1、 E2 和 非结构蛋白P7、NS2、 NS3、 NS4A、NS4B、 NS5A 和 NS5B，其中 C、 E0、E1、 E2 为重要的结构蛋白，尤其是E2蛋白，是主要的保护性抗原结构蛋白，具有较强的免疫原性和反应原性[10-11]，可诱导中和抗体的产生[12-14]。

目前，国内外市售猪瘟检测试剂盒较多，均为检测猪瘟抗体，用来评估猪场疫苗免疫效果。为配合猪瘟净化政策，需要研制猪瘟野毒抗体检测试剂盒。本项目利用杆状病毒表达系统表达的猪瘟野毒E2蛋白作为包被抗原，用针对猪瘟野毒的单克隆抗体经过辣根过氧化物酶(HRP)标记后作为酶标抗体建立阻断ELISA检测方法。本研究中使用的猪瘟野毒单克隆抗体为猪瘟野毒株E2蛋白作为免疫原而制备的，其只与不同亚型的猪瘟野毒株发生反应，与猪瘟兔化弱毒疫苗株(C株)不反应[15-16]。因此，该单抗可与临床样本中感染猪瘟野毒后产生的抗体竞争性结合包被于抗原板上的猪瘟野毒E2蛋白，有效阻断样本中的野毒抗体与包被抗原的反应，通过计算阻断率判定样本中猪瘟野毒感染情况。该方法可用于临床上猪瘟野毒感染猪的筛查，为猪瘟净化计划提供真实的参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

酶标板购自厦门怡佳美实验器材有限公司；猪瘟野毒阳性参考品、猪瘟阴性参考品、猪瘟免疫参考品、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)阳性血清、猪圆环病毒2型(PCV2)阳性血清、猪细小病毒(PPV)阳性血清、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)阳性血清均购于中国兽医药品监察所；辣根过氧化物酶购自SIGMA公司；辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG多抗购自SIGMA公司；猪瘟野毒单抗细胞株购自广州伯尼兹生物科技有限公司[17]；猪瘟野毒E2蛋白、猪瘟野毒单抗和酶标野毒单抗为世纪元亨自制；369份猪瘟阴性血清、84份临床猪血清由世纪元亨检测中心提供(其中78份免疫血清，为免疫哈尔滨元亨药业有限公司的猪瘟活疫苗的猪场中获得；6份猪瘟野毒血清为有猪瘟感染的猪场获得)；其他化学试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 猪瘟野毒E2蛋白特异性鉴定

采用间接ELISA方法对猪瘟野毒E2蛋白的特异性进行鉴定。将猪瘟野毒E2蛋白稀释至0.1 μg/mL的包被浓度，100 μL/孔，加样完毕后用封板膜覆盖反应板，2～8 ℃放置16～18 h。用PBST洗板1次，每孔加5% 脱脂奶粉，2～8 ℃封闭24 h。将猪瘟野毒阳性参考品、猪瘟免疫参考品、猪瘟阴性参考品、PRRSV阳性血清、PCV2阳性血清、PPV阳性血清、BVDV阳性血清分别进行1∶10稀释，100 μL/孔，37 ℃反应1 h，PBST洗5次。将辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG多抗1∶5 000进行稀释，100 μL/孔，37 ℃反应30 min，PBST洗5次。每孔先加入50 μL 的底物A再加入50 μL 底物B，37 ℃反应10 min，每孔加入50 μL终止液，读取OD450值，计算阻断率。

1.2.2 抗原最佳包被浓度和酶标单抗最佳稀释度的确定

采用棋盘滴定法。将猪瘟野毒E2蛋白用CB包被液按照1∶500、1∶1 000、1∶3 000、1∶5 000、1∶7 000、1∶10 000进行稀释，充分混匀后于96孔微量反应板上横向包被，100 μL/孔，加样完毕后将反应板贴上封板膜，2～8 ℃放置16～18 h。用PBST洗板1次，每孔加5% 脱脂奶粉，2～8 ℃封闭24 h。猪瘟野毒阳性参考品、猪瘟阴性参考品按照1∶1进行稀释，100 μL/孔，37 ℃反应1 h，PBST洗5次。将猪瘟野毒酶标单抗进行1∶500、1∶1 000、1∶2 000稀释后自上而下加入到反应板内，100 μL/孔，37 ℃反应30 min，PBST洗涤5次，每孔先加入50 μL 的底物A再加入50 μL 底物B，37 ℃反应10 min，每孔加入50 μL终止液，读取OD450值，计算阻断率，选择猪瘟野毒阳性参考品阻断率最高点对应的E2抗原包被浓度和酶标单抗浓度为最佳条件。

1.2.3 包被条件确定

1.2.3.1 包被液的选择

按照已确定好的E2蛋白最佳包被浓度，分别选用碳酸盐缓冲液(pH=9.6)、Tris-HCl(pH=8.0)、磷酸盐缓冲液(pH=7.2)作为包被液进行包被，100 μL/孔，经封闭液封闭后，与猪瘟阴性参考品反应OD450值最高者即为蛋白吸附效果最好的包被液。

1.2.3.2 包被条件的摸索

按照已确定好的试验条件，分别选择2～8 ℃ 10 h、2～8 ℃ 14 h、2～8 ℃ 18 h、2～8 ℃ 24 h、37 ℃ 2 h、37 ℃ 4 h，6个包被条件进行包被，100 μL/孔，经封闭液封闭后，与阴性参考品进行反应，选择阴性参考品OD450值高且孔间变异系数小的包被条件进行包被。

1.2.4 封闭液的选择

按照已确定好的试验条件，分别选择5% BSA、10%脱脂奶粉、10%马血清、10% 新生牛血清、1%酪蛋白作为封闭液进行封闭，封闭条件为2～8 ℃ 24 h。比较猪瘟阴性参考品的OD450值及N/P值，确定最佳封闭液的成分。

1.2.5 血清稀释液的选择

按照已确定好的试验条件，分别比较5% BSA、5%新生牛血清、10%马血清、10%脱脂奶粉、10%新生牛血清作为稀释液的效果。用上述稀释液分别对猪瘟野毒阳性参考品和猪瘟阴性参考品进行稀释，比较猪瘟野毒阴性参考品的OD450值、猪瘟野毒阳性参考品的阻断率及N/P值，从中选择阴性参考品OD450值高、阳性参考品阻断率高及N/P值高的稀释液作为血清稀释液。

1.2.6 血清稀释倍数的选择

用确定好的包被条件和封闭条件进行包被板制备，将猪瘟野毒阳性参考品、猪瘟免疫参考品和猪瘟阴性参考品分别按照1∶1、1∶4、1∶8进行稀释，每孔加100 μL，37 ℃反应1 h，PBST洗板5次，每孔加入100 μL猪瘟野毒酶标单抗，37 ℃反应30 min，PBST洗板5次，每孔先加入50 μL 的底物A再加入50 μL 底物B，37 ℃反应10 min，每孔加入50 μL终止液，读取OD450值，计算猪瘟野毒阳性参考品、猪瘟免疫参考品阻断率。

1.2.7 底物反应时间的确定

将猪瘟阴性参考品和猪瘟野毒阳性参考品加到微量反应板中，37 ℃反应1 h。PBST洗涤5次，每孔加入100 μL猪瘟野毒酶标单抗，37 ℃反应30 min。PBST洗涤5次后，加入底物液，设置5个显示条件，分别为室温10 min、37 ℃ 5 min、37 ℃ 10 min、37 ℃ 15 min、37 ℃ 20 min，比较阴性参考品与野毒阳性参考品的比值，选择比值最高的反应时间作为显色时间。

1.2.8 阴阳临界值的确定

用以上建立的阻断ELISA方法，检测369份猪瘟野毒阴性血清，该血清为世纪元亨于合作猪场中收集的未免疫猪瘟疫苗的血清，其经过国际贸易指定的荧光抗体病毒中和试验(FAVN)[18]进行验证，均为猪瘟抗体阴性。计算阻断率(%)=(阴性对照OD450平均值-样品OD450值)/阴性对照OD450平均值×100%，测定血清样本阻断率的平均值(X)和标准偏差(SD)。确立阴阳判界为(X+3SD)，当血清样本阻断率>(X+3SD)时判为阳性；当血清样本阻断率≤(X+3SD)时判为阴性。

1.2.9 初步临床应用

用建立的阻断ELISA检测方法检测84份临床猪血清，验证该方法的应用情况。其中78份为免疫世纪元亨的猪瘟活疫苗的血清，其采自正规猪场，该猪场免疫背景清晰，并且每年定期采样进行RT-PCR检测，CSFV均为阴性，无猪瘟感染史。78份血清经过世纪元亨的CSFV抗体间接ELISA检测试剂盒(用于疫苗评估)测定，抗体水平一致，离散度均一，免疫效果较好。该血清同时由FAVN试验测定，均为免疫抗体阳性；另6份为CSFV感染血清，来自有猪瘟感染的猪场。6头猪用RT-PCR方法进行了扁桃体带毒情况检测，均为阳性。用FAVN试验检测该6头猪采取的血清，均为阳性，证实该6份血清为猪瘟野毒感染血清。

2 结果与分析

2.1 猪瘟野毒E2蛋白特异性鉴定

采用间接ELISA方法对猪瘟野毒E2蛋白的特异性进行鉴定。猪瘟野毒E2蛋白以0.1 μg/mL包被，制备反应板，分别将猪瘟野毒阳性参考品、猪瘟免疫参考品、猪瘟阴性参考品、PRRSV阳性血清、PCV2阳性血清、PPV阳性血清、BVDV阳性血清以1∶10稀释进行试验，结果见图1。结果表明，猪瘟野毒E2可与猪瘟野毒阳性参考品发生较强的特异性反应，与猪瘟阴性参考品及其他病毒阳性血清无反应。

+为阳性，-为阴性

2.2 猪瘟野毒E2最佳包被浓度和酶标单抗最佳稀释度的确定

通过不同浓度E2包被，确定本检测方法的猪瘟野毒E2蛋白最佳包被量以及猪瘟野毒酶标单抗的最佳使用浓度。由图2可知，当猪瘟野毒酶标单抗使用浓度为1∶1 000、野毒E2包被浓度为1∶5 000(对应的包被浓度为0.03 μg/mL)时，阻断率达到最高值，后续呈现水平状态。综合结果可见，猪瘟野毒E2最佳包被浓度为0.03 μg/mL，且猪瘟野毒酶标单抗最佳稀释比例为1∶1 000。

图2 抗原包被浓度和酶标单抗稀释浓度的确定

2.3 包被条件确定

2.3.1 包被液的选择

通过对3种包被液比较，表明pH=9.6的碳酸盐缓冲液作为包被液时，检测猪瘟阴性参考品OD450值最高，效果最好，见图3，因此选择pH=9.6的碳酸盐缓冲液作为包被液。

图3 最佳包被液的确定

2.3.2 包被条件的摸索

对6个不同包被条件进行比较，结果见图4，可知，2～8 ℃包被18 h时，阴性参考品OD450值最高，蛋白吸附量最好，并且包被的板子变异系数最小，最为稳定。因此确定2～8 ℃包被18 h作为包被条件。

图4 最佳包被条件的确定

2.4 封闭液的选择

通过对多种封闭液的封闭效果进行比较， 选择阴性参考品OD450值较高且N/P值较高的作为封闭液，结果见图5。从图中可以看出，10%马血清作为封闭液时，阴性参考品的OD450值和N/P值均最高，因此，选择10%马血清作为封闭液。

图5 最佳封闭液的确定

2.5 血清稀释液的选择

通过对多种稀释液进行比较，选择阴性参考品OD450值较高且N/P值较高的作为稀释液，结果见图6，以5%的新生牛血清作为血清和酶的稀释液为最佳。

图6 最佳血清稀释液的确定

2.6 血清稀释倍数的选择

由图7可知，在猪瘟野毒阳性参考品阻断率基本不受影响的同时，当血清稀释比例为1∶4时，免疫血清抗体降低效果更明显，因此最终血清稀释比例定为1∶4。

2.7 底物反应条件的确定

不同底物显色时间对显色效果进行比较，结果见图8。综合考虑阴性对照OD450值、N/P值以及试验操作的便捷性等，最终确定底物显色条件为37 ℃，10 min为最佳。

图7 最佳血清稀释倍数的确定

图8 最佳底物反应条件的确定

2.8 阴阳临界值的确定

用以上建立的阻断ELISA方法，检测369份猪瘟野毒阴性血清，计算血清样本阻断率的平均值为11.42和标准偏差为9.36，X+3SD=39.51。因此确立阴阳判界为，当阻断率>40%时判为阳性，当阻断率≤40%时判为阴性。

2.9 初步临床应用

用建立的阻断ELISA方法检测收集的84份猪临床血清，结果见图9，其中6份CSFV感染血清检测为猪瘟野毒抗体阳性，其他78份免疫血清均检测为猪瘟野毒抗体阴性。

图9 84份临床血清检测

3 讨论

猪瘟是危害我国养猪业发展的头号疫病。近年来在免疫压力及各种环境变化等因素的影响下，猪瘟的流行特点发生了很大的变化，给养猪生产造成巨大的经济损失[19]。虽然我国应用猪瘟兔化弱毒疫苗已有60多年，但至今仍未能根除猪瘟，其主要原因是，疫苗免疫程序混乱，带毒种猪，免疫耐受，相应政策法规不健全等[3]。猪瘟常和其他的疾病混合感染，造成病理变化和临床症状越来越复杂，给猪瘟的临床诊断与防治带来极大困难[20]。目前种猪群中CSFV持续带毒感染不仅导致严重的繁殖障碍，而且引起新生仔猪的死亡和免疫耐受，母猪的带毒感染已成为CSFV传播的主要原因之一。为此，开展猪群的CSFV净化已刻不容缓。

目前关于猪瘟抗体ELISA检测方法的研究有很多[21-24]，并且国内外猪瘟抗体检测试剂盒也较多，但均用于评估猪场疫苗免疫效果，没有猪瘟野毒抗体检测试剂盒上市，无法区分CSFV自然感染动物和C株疫苗免疫动物的血清抗体。

为查清猪群中猪瘟野毒感染情况，进一步为制定规模化猪场猪瘟控制净化措施做准备，本项目利用猪瘟野毒E2和针对猪瘟野毒E2的单克隆抗体作为原料建立了阻断ELISA检测方法。该方法中的单抗仅与猪瘟野毒株反应，与C株不反应，因此可与样本中的野毒抗体竞争结合包被抗原，进而确定猪只感染猪瘟的情况。目前，虽然针对CSFV的单克隆抗体研究较多[25-28]，但均未研制成猪瘟野毒抗体检测试剂盒。本研究建立了猪瘟野毒抗体阻断ELISA检测方法并进行了初步验证，共检测84份临床血清，检测结果与血清已知背景一致。本试验建立的抗体阻断ELISA方法可初步用于临床上猪瘟野毒感染猪的筛查，为猪瘟净化计划提供真实的参考依据。