滤纸搭桥法在食品检验中对沙门菌血清型鉴定的应用探究

吴欣欣，程 媛，余土养，潘梅珍

婺源县疾病预防控制中心 (上饶 333200)

沙门菌属是引起食物中毒的重要病原菌，该菌的株型繁多，迄今世界上已鉴定出2 500多个不同的沙门菌血清型，分属于近50个血清组[1]。我国已检出的血清型数至少320个，食物中毒检出率最高的依次是肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌、德尔卑沙门菌、都柏林沙门菌四个血清型[2]。因此正确鉴定沙门菌的血清型对确定人和动物沙门菌病的感染源及降低沙门菌病发病率有重要的意义。为提高沙门菌血清分型的准确性，在GB 4789.4—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验》的基础上[3]，对用简易平板法无法准确确定血清分型的沙门菌用滤纸搭桥法[4,5]做进一步的鞭毛抗原诱导及血清型鉴定。

1 材料与方法

1.1 主要材料

血平板，批号20190927，有效期20191226，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；半固体培养基，批号20180423，有效期3年，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；沙门氏菌属诊断血清，批号20190101，有效期20210106， 宁波天润生物药业有限公司；生理盐水，本中心实验室自配；沙门菌菌株， 菌株均分离于2015～2019年婺源县疾病预防控制中心食品污染物和有害因素风险监测的食品(生畜肉、即食食品、预制水产品、外卖等)，所有菌株均已做生化鉴定，同时已用诊断血清作玻片凝集试验，确定了O群和一个H位相，并且另一H位相暂时无法确定。

1.2 主要仪器与设备

无菌手术刀；无菌小镊子；0.5 cm×1.5 cm无菌滤纸(用普通滤纸剪成所要求尺寸后包装好经高压灭菌后使用)；LRH-150型生化培养箱，36 ℃±1 ℃，上海一恒科技股份有限公司；BSC-1500Ⅱ型生物安全柜，过滤效率>99.999%，山东鑫贝西生物技术股份有限公司；微生物实验室常规灭菌及培养设备。

1.3 方法

1.3.1简易平板法[3]

将0.35%～0.40%半固态琼脂平板烘干表面水分，挑取待检菌株相应的抗血清一环，滴在半固态平板表面，放置片刻，待血清吸收到琼脂内，在血清部位的中央点种待检菌株，36 ℃±1 ℃培养24～48 h，取成蔓延生长的菌苔边缘菌落进行血清型鉴定。通常要进行数次诱导培养，确定另一相H位相，如经多次诱导仍未出现另一位相，而且诱导方法可靠，则应考虑此菌株可能是单相菌[2]。

1.3.2滤纸条搭桥法[4,5]

用无菌手术刀沿血平板中间线切除一条0.5～1.0 cm宽的培养基，将血平板上的培养基分成没有接触点的A、B 2个独立区域，用无菌小镊子夹取2根滤纸条架于 2个独立区域之间，形成A、B区域间两条相距2 cm的“桥”。

在滤纸条中间滴加待检菌株相应的因子血清10～15 μL，同时用接种环取少量菌苔轻轻涂抹在A区滤纸条边缘的血培养上，36 ℃±1 ℃倒置培养24～48 h，利用滤纸条的吸附作用，菌落沿湿润滤纸条向另一端蔓延生长，途中已知H抗原被滤纸条上的抗血清吸附，取B区新生长的菌苔边缘菌落进行血清型鉴定。

2 结果与讨论

2.1 简易平板法及菌株培养

图1为加因子血清Hd后的半固体培养基平板，待血清吸收到琼脂内，在血清部位的中央点种已知O抗原4,5,12和H抗原d的待分型沙门菌，于37 ℃诱导培养48 h。图2为培养48 h后的半固体培养基平板，菌落呈片状生长，取边缘菌落玻片凝集试验，未发现可凝集的H血清，可判断此沙门菌的抗原结构为4,5,12:d:-。

图1 加因子血清后的半固体培养基平板

图2 诱导培养48 h后的半固体培养基平板

2.2 滤纸条搭桥及菌株培养

图3为已分区、加滤纸条搭桥后的血平板，A区滤纸条边缘分别接种待检沙门菌，于37 ℃诱导培养48 h。1号滤纸条A区接种已知O抗原4,5,12和H抗原d的待分型沙门菌，滤纸条中间滴加Hd；2号滤纸条A区接种已知O抗原4,5,12和H抗原1,2的待分型沙门菌，滤纸条中间滴加H1,2；3号滤纸条A区接种已知O抗原4,5,12和H抗原i的待分型沙门菌，滤纸条中间滴加Hi；4号滤纸条A区接种已知O抗原4,5,12和H抗原i的待分型沙门菌，滤纸条中间滴加Hi。

图3 已分区、加滤纸条搭桥的血平板

图4为诱导培养48 h后的血平板，可以看出1、2号滤纸条B区有菌落生长，取滤纸条边缘菌落做玻片凝集试验，1号滤纸条B区菌落H抗原1,2凝集，抗原结构为4,5,12:d:1,2；2号滤纸条B区菌落H抗原e,h凝集，抗原结构为4,5,12:e,h:1,2；3、4号滤纸条B区无菌落生长，可判断3、4号A区接种的待分型沙门菌抗原结构均为4,5,12:i:-。

图4 诱导培养48 h后的血平板

2.3 血清型鉴定结果

表1 食品中检出沙门菌的血清型鉴定结果

依据世界卫生组织国际沙门菌中心在2007年公布的第九版White-Kauffmann-Le Minor 抗原表(简称K-W表)，对食品中检出沙门菌进行血清型确定，血清型鉴定结果如表1所示。其中，鼠伤寒沙门菌、肠炎沙门菌、里森沙门菌、都柏林沙门菌用简易平板法和滤纸条搭桥法检出相同的抗原结构，查K-W表可确定里森沙门菌，肠炎沙门菌，都柏林沙门菌。同时K-W表上显示鼠伤寒沙门菌存在i单相变种，故也可以确定鼠伤寒沙门菌。另外，斯坦利沙门菌、圣保罗沙门菌、维尔肖沙门菌和病牛沙门菌的菌株在琼脂斜面上经三次传代后用简易平板法仍不能诱导出未知H抗原，同时在K-W表上未找到与其抗原结构匹配的单相菌，不能准确分型，但是经滤纸条搭桥法能快速得到H抗原结构，准确确定另一H位相。由以上结果可以看出，滤纸条搭桥法与简易平板法相比较，传代次数更少，所耗时间更为短暂，且血清分型结果更为准确。

3 结论

研究表明，世界上已鉴定出的沙门菌血清型数有2 500多个，能够感染人类的致病菌株主要集中于4个血清组(即血清组A、B、C和D)，其中伤寒沙门菌、乙型副伤寒沙门菌、丙型副伤寒沙门菌、鼠伤寒沙门菌、婴儿沙门菌、肠炎沙门菌、猪霍乱沙门菌和鸡沙门菌等8种血清型是最常见的感染人体和禽畜类动物的菌型[1,5]。我国已检出的血清型数至少320个，其中引起食物中毒检出率最高的依次是肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌、德尔卑沙门菌、都柏林沙门菌四个血清型，其次为明斯特沙门菌、里森沙门菌和斯坦利沙门菌[2,6]。故正确鉴定沙门菌的血清型对确定人和动物沙门菌病的感染源及降低沙门菌病发病率有重要的意义。

随着分子分型技术的发展，采用多重PCR、脉冲场凝胶电泳、液相悬浮芯片技术等越来越多的方法可以快速准确的对沙门菌进行血清分型[7-11]。但是在实际检验工作中，大部分县级基层实验室尚不能达到分子分型技术要求，运用血清分型仍是鉴定沙门菌最广泛、最基础的分型方法。由于大多数沙门菌具有两个或者更多的位相，通常位相之间能发生可逆性变异，一般不能直接确定所有位相，要用位相变异试验方法通过已知位相确定其另一位相。目前，应用国家标准GB 4789.4—2016中的血清学鉴定方法，多数能做到血清分型，但是仍有部分沙门菌常遇到凝集效价不高、结果不易判断、传代多次依然不能准确分型。本实验是在国家标准GB 4789.4—2016血清学鉴定方法的基础上，对结果仍不明确的菌株采用滤纸条搭桥法进行进一步鞭毛诱导及鉴定，虽然试验菌株只有31株，依据不够充足，但已知结果表明滤纸条搭桥法对沙门菌的鞭毛抗原诱导效果更佳，耗时更短，准确性更高，在沙门菌血清分型实际检验工作中可以把滤纸条搭桥法作为国家标准GB 4789.4—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验》方法的补充。