大鼠肉瘤基因同源物及其相关卷曲螺旋蛋白激酶信号通路在呼吸机相关性肺损伤中的作用

陈 勇 孙 静 郭 莲 胡小兰 郎海丽 王 忠 胡衍辉 徐国海

目前，机械通气已成为治疗呼吸衰竭、各种器官衰竭，以及用于全身麻醉(简称全麻)手术等过程的一项关键技术。有研究[1]结果表明，呼吸机使用不当可能对正常肺组织造成损伤或加重肺组织损伤，即呼吸机相关性肺损伤(ventilator induced lung injury，VILI)，其主要病理特征为炎症细胞浸润、透明膜形成、血管通透性增加和肺水肿，可导致机体发生气压伤、容积伤、萎陷伤和生物伤等。近年来的研究[2-3]结果表明，机械通气诱发机体炎症细胞激活和炎症介质表达是导致肺损伤发生的关键机制。大鼠肉瘤基因同源物(Rho)是一种小分子鸟苷酸结合蛋白，具有鸟苷三磷酸(GTP)酶活性，广泛分布于哺乳动物的组织细胞中。有研究[4]结果表明，Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶(Rock)在炎症反应中具有相当重要的作用，Rock抑制剂可抑制多形核白细胞渗出和炎症细胞因子TNF-α、IL-6的产生，从而减轻炎症反应，但其能否减轻VILI目前尚不清楚。本研究通过评价Rho/Rock信号通路在VILI中的作用，以及法舒地尔对VILI的保护作用，旨在为临床治疗VILI提供理论基础和科学依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2019年1—5月在南昌大学第二附属医院行择期全麻下机械通气时间≥4 h的普通外科手术患者60例，男33例、女27例；年龄范围20～60岁，年龄为(46±8)岁；ASA分级Ⅰ或Ⅱ级。采用随机数字表法将患者分为法舒地尔组和0.9%氯化钠组(对照组)，每组30例。排除标准：机械通气时间<4 h，严重颅脑损伤，恶性肿瘤，严重心、肺、肝、肾功能异常，阿片类药物过敏史和滥用史，血流动力学不稳定，正在参与其他临床试验。本研究经医院医学伦理委员会审核批准(批准号为2017第32号)，患者及其家属均签署知情同意书。

1.2 方法 所有患者术前均未给予任何药物。入手术室后连接心电监护仪，于局部麻醉下行桡动脉穿刺。静脉注射咪达唑仑0.05 mg/kg、芬太尼3.5 μg/kg、依托咪酯0.3 mg/kg、顺阿曲库铵0.15 mg/kg行麻醉诱导，气管插管后行机械通气。法舒地尔组于麻醉诱导后给予法舒地尔(天津红日药业股份有限公司)30 mg(以100 mL 0.9%氯化钠溶液稀释)静脉注射，于15 min内注射完毕；对照组给予等容量0.9%氯化钠溶液静脉注射。机械通气的参数设置：FiO2100%，气道平台压(pplat)<35 cmH2O(1 cmH2O=0.098 kPa)，PEEP 5～20 cmH2O，通气频率8～12次/min，潮气量8～10 mL/kg，吸呼比为1∶2，维持呼气末二氧化碳分压35～45 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)。给予异丙酚0.2～0.4 mg/(kg·min)、瑞芬太尼0.1～0.2 μg/(kg·min)、顺阿曲库铵2～3 μg/(kg·min)静脉注射维持麻醉，维持脑电双频指数(BIS)为40～60。监测血压、心率、经皮动脉血氧饱和度(SpO2)和心电图。手术结束待患者自主呼吸恢复后，给予新斯的明和阿托品拮抗肌肉松弛药，拔除气管导管后送至麻醉恢复室(PACU)，给予面罩吸氧，给予患者静脉自控镇痛(PCIA)。PCIA配置：舒芬太尼2 μg/kg+0.9%氯化钠溶液至100 mL，负荷剂量2 mL，持续输注量2 mL/h，患者自控镇痛(PCA)量1 mL，锁定时间15 min。

1.3 血管活性药物使用 术中酌情使用阿托品、多巴胺、去氧肾上腺素等血管活性药物调控心率和血压。若术中患者心率<50次/min时，静脉注射阿托品；血压<基础值的30%时，静脉注射去氧肾上腺素或多巴胺。

1.4 观察指标 比较两组患者的一般情况。记录两组患者手术过程中呼吸机参数(潮气量、峰流速、呼吸频率、PEEP)。分别于麻醉诱导前和麻醉苏醒后进行急性生理学与慢性健康状况评价Ⅱ(APACHE Ⅱ)评分。分别于机械通气前后采集患者的外周静脉血和动脉血样本，测定血清Rock水平并行血气分析(血气分析指标为paO2、氧合指数、呼吸指数)。分别于机械通气前后收集患者的支气管肺泡灌洗液(BALF)，采用ELISA法测定BALF中髓过氧化物酶(MPO)、TNF-α、IL-6、RhoA和Rock2水平。记录两组患者术后7 d肺部并发症(肺部感染、肺不张、支气管痉挛和呼吸衰竭)的发生情况。

1.5 并发症的诊断标准[5]肺部感染(至少满足以下1条)：高热，频繁咳嗽、咳痰，肺部听诊异常，胸部X线摄片提示新出现的肺部渗出或者原有的渗出增多，血常规检查白细胞计数>12×109/L。肺不张：氧合差且患侧肺部听诊呼吸音低，或者胸部X线摄片提示肺组织透亮度降低伴纵隔、肺门和患侧横膈向不张区域移动，健侧肺代偿性的过度通气。支气管痉挛：呼吸困难，肺部听诊有广泛的哮鸣音，需药物治疗才能缓解。呼吸衰竭：术后吸空气时paO2<60 mmHg，或者氧合指数<300 mmHg，或者SpO2<90%且需吸氧治疗。

2 结 果

2.1 一般情况比较 两组患者间年龄、性别构成、体重、ASA分级构成和手术时间的差异均无统计学意义(P值均>0.05)。见表1。

表1 两组患者一般情况的比较 (N=30)

2.2 手术过程中呼吸机参数比较 两组间患者手术过程中潮气量、峰流速、呼吸频率和PEEP的差异均无统计学意义(P值均>0.05)。见表2。

表2 两组患者手术过程中呼吸机参数的比较

2.3 麻醉诱导前和麻醉苏醒后APACHE Ⅱ评分比较 对照组麻醉诱导前和麻醉苏醒后APACHE Ⅱ评分分别为(10.5±3.7)、(6.5±2.3)分，法舒地尔组分别为(10.9±3.4)、(8.3±2.6)分。两组间麻醉诱导前APACHE Ⅱ评分的差异无统计学意义(P>0.05),法舒地尔组麻醉苏醒后APACHE Ⅱ评分显著高于对照组麻醉苏醒后(P<0.05)。

2.4 机械通气前后血清Rock水平和血气分析指标比较 两组间机械通气前血清Rock水平和氧合指数、呼吸指数、paO2的差异均无统计学意义(P值均>0.05)。法舒地尔组机械通气后氧合指数显著高于对照组机械通气后(P<0.05)，血清Rock水平和呼吸指数均显著低于对照组机械通气后(P值均<0.05)；两组间机械通气后paO2的差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 两组患者机械通气前后血清Rock水平和血气分析指标的比较

2.5 机械通气前后BALF中MPO、TNF-α、IL-6、RhoA和Rock2水平比较 两组间机械通气前BALF中MPO、TNF-α、IL-6、RhoA和Rock2水平的差异均无统计学意义(P值均>0.05)。法舒地尔组患者机械通气后BALF中MPO、TNF-α、IL-6、RhoA和Rock2水平均显著低于对照组机械通气后(P值均<0.05)。见表4。

表4 两组患者机械通气前后BALF中MPO、TNF-α、IL-6、RhoA和Rock2水平的比较

2.6 术后7 d肺部并发症情况比较 术后7 d，法舒地尔组肺部并发症发生率为3.3%(1/30)，仅1例患者发生肺部感染；对照组肺部并发症发生率为16.7%(5/30)，其中肺部感染3例、支气管痉挛2例；两组患者均未发生肺不张和呼吸衰竭。法舒地尔组术后7 d肺部并发症发生率显著低于对照组(P<0.05)。

3 讨 论

VILI是指由机械通气引起的各种肺部改变的总称，临床上将其分为气压伤、容积伤、萎陷伤、生物伤4种类型。VILI的发生是由多种因素共同作用的结果，既有机械力对肺组织细胞的直接损伤，也有激活的炎症细胞和炎症介质介导的肺局部炎症反应(即生物伤)，其在分子水平促进大量炎症因子释放，通过炎症反应的级联放大，造成组织损伤[6]。研究[7]发现，在大鼠机械通气肺损伤模型中，TNF-α水平明显升高，诱导中性粒细胞、上皮细胞生成IL-8的能力增强，而IL-8可加重肺泡毛细血管内皮细胞损伤和肺水肿，进而诱发中性粒细胞、巨噬细胞等释放IL-6和IL-1等炎症因子，进一步加重组织损伤。据最新统计，行机械通气的患者VILI发生率高达15%[8]。因此，探讨VILI的主要致病因素，研究其有效治疗药物是临床亟待解决的问题。

法舒地尔作为首个抑制肌球蛋白轻链磷酸化的新型血管扩张剂，主要通过抑制Rock发挥药理作用，其能够抑制钙敏化效应，降低内皮细胞的张力，扩张血管，防止缺血-再灌注损伤的发生，从而改善脑组织微循环，减少心肌细胞凋亡，同时也可拮抗炎症细胞因子，改善血液动力学，目前已被广泛用于治疗冠状动脉微循环障碍和脑血管病[9]。Rho/Rock信号通路与多种基因的表达有关，Rho GTP酶能被多种炎症介质和细胞因子活化，继而激活Rho/Rock信号通路，这些炎症介质和细胞因子是引起多种炎症损伤和纤维组织增生性疾病发生的重要基础物质。因此，抑制Rho/Rock信号通路可减少炎症反应发生。相关的动物研究[10-11]结果表明，法舒地尔作为Rock抑制剂可减轻肺组织炎症损伤和肺水肿，降低MPO、TNF-α、IL-6水平，从而改善疾病的预后。

本研究采用随机数字表法对患者进行分组，两组间患者的一般情况和手术过程中呼吸机参数的差异均无统计学意义，从而排除了呼吸机参数设置对研究结果产生的影响。动物实验结果表明，VILI发生率随着机械通气时间的延长而增高；Toll样受体是参与天然免疫的一类重要蛋白质分子，是机体抵抗感染性疾病的第一道屏障，其表达量随着机械通气时间的延长而增高，机械通气240 min时Toll样受体表达量显著高于机械通气60 min时[12]。因此，本研究选择择期行全麻手术且机械通气时间≥4 h的患者，参考文献[13]的方法，法舒地尔组于麻醉诱导后以法舒地尔30 mg经100 mL 0.9%氯化钠溶液稀释后静脉注射，于15 min内注射完毕；结果显示，法舒地尔组患者机械通气后血清Rock水平显著低于对照组机械通气后，表明机械通气后法舒地尔可抑制血清中Rock的表达。

BALF中炎症因子MPO、TNF-α、IL-6水平与大叶性肺炎、重症肺炎等疾病的严重程度密切相关，炎症因子水平越高，病情越严重；此外，根据炎症因子水平变化可判断疾病的预后[14]。VILI患者BALF中MPO、TNF-α和IL-6水平均显著升高，MPO是中性粒细胞的特征酶，其活性反映了中性粒细胞的浸润程度；TNF-α和IL-6是由血管内皮合成和释放的，导致全身炎症反应启动的主要促炎因子，TNF-α具有抗肿瘤和调节机体免疫功能的作用，并参与机体炎症等多种病变发生、发展的过程，可诱发自身和其他细胞因子释放而损伤机体；IL-6是由肺组织内不同细胞，如肺泡巨噬细胞、内皮细胞等受到牵拉刺激时激活产生，其水平急剧升高(即炎症因子大量激活)为炎症急性期的表现，其与肺损伤和肺部并发症的发生密切相关。本研究结果显示，法舒地尔组患者机械通气后BALF中MPO、TNF-α、IL-6、RhoA和Rock2水平均显著低于对照组机械通气后，表明法舒地尔作为Rock抑制剂，可减少血清中促炎症因子释放，以及炎症因子浸润肺泡上皮细胞和毛细血管内皮细胞，从而起到减轻VILI的作用。本研究结果显示，法舒地尔组机械通气后氧合指数显著高于对照组通气后，呼吸指数显著低于对照组机械通气后；麻醉苏醒后APACHE Ⅱ评分显著高于对照组麻醉苏醒后，术后7 d肺部并发症发生率显著低于对照组。上述结果表明，法舒地尔作为Rock抑制剂可减轻VILI，减少术后肺部并发症的发生，该作用机制可能与其抑制Rho/Rock信号通路后减轻炎症反应有关。

综上所述，Rock抑制剂法舒地尔可减轻患者机械通气时VILI，减少术后肺部并发症的发生，该作用机制可能与其抑制Rho/Rock信号通路后减轻炎症反应有关。