布氏乳杆菌和纤维素酶对青贮玉米秸秆品质影响研究

刘 辉，李金鑫，鹿 瑶，徐海燕，谷 巍

（山东宝来利来生物工程股份有限公司 山东省动物微生态制剂省级重点实验室，山东 泰安 271000）

目前我国草食家畜粗饲料的主要来源是青贮， 近年玉米秸秆作为反刍动物粗饲料成为研究热点，但玉米秸秆中粗纤维含量高，体积大，质地粗硬，可直接利用率低，适口性差，饲喂前需进行前处理，降低粗纤维含量，提高消化率，改善适口性。青贮是玉米秸秆处理的较常见方法之一。然而作为青贮的秸秆原料中含有较高的纤维素， 且纤维素不能被乳酸菌直接利用或被反刍动物充分消化， 造成粗饲料可利用营养价值和动物消化率提升空间较小，降低了青贮秸秆的利用率。

大量研究发现乳酸菌和纤维素酶的使用，可以较好地改善青贮秸秆饲料品质，提高营养价值。Sheperd 等［1］研究发现在紫花苜蓿青贮制作时添加纤维素酶和乳酸菌， 可降低酸性洗涤纤维和中性洗涤纤维含量，碳水化合物含量持续增加，促进乳酸发酵并提升了青贮发酵品质。 Cai 等［2］研究结果表明在羊草和苜蓿青贮中同时添加乳酸菌和纤维素酶，可促进发酵，提升发酵品质，抑制腐败菌产气，并提高干物质消化率。 席兴军等［3］在青贮玉米秸秆中添加纤维素酶和乳酸菌， 青贮中氨态氮下降28%， 丁酸下降100%， 酸性洗涤纤维降低20%，显著提升了青贮玉米秸秆的营养价值。 赵政等［4］对早籼稻秸秆青贮添加乳酸菌和纤维素酶，发现酸性洗涤纤维和中性洗涤纤维含量降低，而粗蛋白含量增加。 万里强等［5］使用乳酸菌和纤维素酶青贮苜蓿，结果表明氨态氮明显下降，乳酸含量增加，青贮效果综合评分高达93 分。

在青贮制作或取饲时，由于密封不严，青贮饲料与氧气接触，霉菌和酵母菌等腐败菌繁殖，造成青贮有氧腐败，营养成分大量流失或毒素积累，造成青贮饲料浪费，甚至引起动物中毒，降低生产性能， 因此， 提高青贮饲料有氧稳定性尤为重要。Weinberg 等［6］发现布氏乳杆菌发酵产生具有抑菌作用的乙酸， 可有效抑制青贮开窖后酵母菌、真菌、 丝状菌等腐败菌的活动， 提高青贮有氧稳定性。 Danner 等［7］对影响青贮有氧稳定性的多种化学物质评价结果表明， 青贮发酵产物中仅乙酸可稳定提高青贮玉米的有氧稳定性，丁酸效果次之，而乳酸、1-丙醇和1，2-丙二醇对有氧稳定性无影响。 Danner 等［7］和Kung 等［8］研究发现，布氏乳杆菌添加量低于5×105CFU/g 时，有氧稳定性无显著提高；当添加剂量高于5×105CFU/g 时，随着添加剂量的增加， 对玉米青贮品质和有氧稳定性的提高效果优于小颗粒谷物饲料和禾本科牧草。Rabjit等［9］证明接种剂量为106CFU/g 布氏乳杆菌组青贮饲料有氧稳定性明显优于丙酸和苯甲酸添加组，但当接种量为105CFU/g 时，效果较丙酸和苯甲酸盐组差。

目前， 国内外对青贮添加剂提升青贮粗饲料发酵品质和有氧稳定性比较关注， 学者们对同型发酵乳酸菌、 异型发酵乳酸菌及同型发酵乳酸菌和纤维素酶联合使用对青贮有氧稳定性和发酵品质的影响研究较多，但对布氏乳杆菌（异型发酵乳酸菌）和纤维素酶联合使用效果评价研究较少，该试验目的是研究布氏乳杆菌和纤维素酶对玉米秸秆青贮饲料发酵品质及有氧稳定性的影响， 为布氏乳杆菌和纤维素酶复合制剂在玉米秸秆青贮粗饲料中的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

布氏乳杆菌菌粉由山东宝来利来生物工程股份有限公司提供， 粉状活菌制剂， 活菌数为5.0×1010CFU/g。

纤维素酶为泰安信得利生物工程有限公司生产粉状酶制剂，酶活为100 000 U/g。

青贮原料：山东省滨州市滨城区西薛家村种植玉米（品种为登海678），玉米籽粒在2/3 乳线期收割，取玉米秸秆，切至2～3 cm 段，作为青贮料制作原料，原料营养成分及微生物情况见表1 和表2。

1.2 试验设计

试验设置空白对照组（CK 组，添加等量无菌水）、布氏乳杆菌接种组（LB 组，接种量为1.0×106CFU/g FM）、纤维素酶添加组（ENZ 组，添加量100 U/g FM）、复合添加组（LB+ENZ 组，布氏乳杆菌接种量为1.0×106CFU/g FM，纤维素酶添加量100 U/g FM）。

1.3 青贮制作

将刈割揉搓好的青贮料制作原料按照试验设计，称重分装，试验共计4 组，每组3 个重复，每个重复4 kg/袋。 接种方法是将每组所需菌粉和纤维素酶溶解至100 mL 无菌水中，边用喷壶均匀喷洒边翻动青贮料，接种混合完毕后装袋，用气泵抽除袋内空气，拉伸缠绕膜多层包裹，堆放在避光阴凉处进行发酵。

1.4 测定项目及方法

1.4.1 干物质含量 取100 g 青贮样， 置于65 ℃烘箱中48 h，至恒重，冷却称重，采用如下公式计算干物质含量［10］。

1.4.2 pH 值测定 根据青贮饲料质量评定标准制备青贮饲料样品制备提取液， 用精密酸度计测pH 值［11］。

1.4.3 发酵产物测定 粗蛋白（CP）含量用凯氏定氮法进行测定［12］。 水溶性碳水化合物（WSC）含量采用蒽酮比色法测定。 粗脂肪含量采用索氏提取法测定。 氨态氮（NH3-N）、粗纤维（CF）、中性洗涤纤维（NDF）和酸性洗涤纤维（ADF）含量利用范氏法测定［13］。 青贮饲料中有机酸提取［14］：取5 g 待测样品于离心管中， 加入30 mL 超纯水， 并加入H2SO4酸化使pH 值＜2，盖紧盖子，于4 ℃条件下浸提24 h，离心取上清液，用液相色谱法测定乳酸、乙酸含量［12］。 取10 g 青贮样品加入含有90 mL 灭菌生理盐水的有塞三角瓶，置于220 r/min、30 ℃摇床30 min，利用梯度稀释法测定乳酸菌、酵母菌活菌数。

1.4.4 有氧稳定性测定 青贮玉米秸秆发酵至45 d 时，每个重复组随机取出500g 样品置于20 cm×30 cm 封口聚乙烯塑料袋内，用无菌牙签扎数个小孔，再套上宽松不封口聚乙烯袋，防止水分损失和交叉污染，置于阴暗处，环境温度控制在25 ℃，将温度记录仪插入青贮样品中心，每小时记录1 次，青贮样品温度超过室温2 ℃为止， 即为青贮有氧稳定性时间［15］。

1.4.5 数据分析 试验数据先用Excel 软件进行初步处理，然后采用SPSS 19.0 进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同处理对青贮玉米秸秆的感官指标及pH值影响

不同处理组45 d 青贮玉米秸秆感官综合评价结果如表3 所示，LB 组、ENZ 组、LB+ENZ 组青贮玉米秸秆的感官综合评分分别比对照组高20.31%、14.06%和25.00%；LB 组和LB+ENZ 组pH 值较CK 组和ENZ 组高，CK 组和ENZ 组基本无差异。

2.2 发酵45 d 时青贮玉米秸秆中微生物含量

发酵45 d 后取样测定各处理组乳酸菌、酵母菌及细菌总数，测定结果见表4。 45 d 时，除LB 组乳酸菌总数略低于初始值， 其他各试验组的乳酸菌含量均高于初始值外，CK 组、ENZ 组、LB+ENZ组乳酸菌数均增加1 个数量级； 各组酵母菌数量均较初始值低，LB 组和LB+ENZ 组降幅最大，分别降至2.23×103、7.10×102CFU/g FM；CK 组、LB 组和ENZ 组细菌总数略有上升， 变化不明显，但LB+ENZ 组细菌总数增至3.50×107CFU/g FM。

表1 玉米秸秆各营养成分质量分数

表2 微生物数量和pH 值检测结果 单位：CFU/g

表3 不同组45 d 青贮玉米秸秆pH 值及感官指标综合评分

2.3 布氏乳杆菌和纤维素酶对青贮玉米秸秆有机酸和氨态氮的影响

不同处理组青贮玉米秸秆发酵45 d 时有机酸和氨态氮（NH3-N）含量测定结果如表5 所示。LB+ENZ 组乳酸含量为2.88%，显著（P<0.05）低于CK 组、LB 组和ENZ 组，LB 组低于ENZ 组， 且差异显著（P<0.05），但CK 组、LB 组和ENZ 组差异不显著（P>0.05）。 LB+ENZ 组乙酸含量达4.48%，显著 （P<0.05） 高于其他3 个处理组，LB 组显著（P<0.05）高于CK 组和ENZ 组，但CK 组和ENZ组无显著差异（P>0.05）。 CK 组乳酸/乙酸值最高（3.43），LB+ENZ 组乳酸/乙酸值最低（0.65），除CK组与ENZ 组差异不显著（P>0.05）外，其他处理组间差异均显著（P<0.05）。 CK 组、ENZ 组丙酸含量分别为0.55%、0.32%，LB 组和LB+ENZ 组均未检出丙酸。 4 个处理组均未检测出丁酸。 CK 组氨态氮含量最高（4.16 g/kg DM），且与其他3 个处理组差异显著（P<0.05），但其他3 组无显著差异（P>0.05）。

2.4 布氏乳杆菌和纤维素酶对青贮玉米秸秆营养成分的影响

各处理组青贮玉米秸秆的营养成分如表6 所示。与CK 组相比，LB 组、ENZ 组、LB+ENZ 组青贮玉米秸秆45 d 时的干物质（DM）、粗脂肪（EE）含量均无显著差异（P>0.05），LB 组干物质（DM）含量最低（25.58%）， 较CK 组降低了4.23%，LB+ENZ组粗脂肪（EE）含量最低（1.56%），较CK 组降低了7.14%，且各处理组的干物质（DM）、粗脂肪（EE）含量均低于CK 组， 且以LB+ENZ 组降低幅度最大。 LB 组粗蛋白（CP）含量低于CK 组（P>0.05），LB 组和CK 组均显著 （P<0.05） 低于ENZ 组和LB+ENZ 组，ENZ 组和LB+ENZ 组差异不显著（P>0.05）。 LB 组中性洗涤纤维（NDF）含量为70.12%，显著 （P<0.05） 高于其他3 个处理组，ENZ 组和LB+ENZ 组含量低于CK 组，但均无显著差异（P>0.05）。 LB+ENZ 组酸性洗涤纤维（ADF）含量最低，显著（P<0.05）低于CK 组和LB 组，与ENZ 组差异不显著（P>0.05）。 与CK 组相比，LB 组、ENZ 组和LB+ENZ 组水溶性碳水化合物（WSC）含量均显著（P<0.05） 增加， 其中LB+ENZ 组含量最高，达6.72%。

表4 发酵45 d 青贮饲料中的微生物数量 单位：CFU/g FM

表5 发酵45 d 青贮玉米秸秆发酵产物

表6 布氏乳杆菌和纤维素酶对青贮玉米秸秆营养成分的影响 单位：%

图1 不同处理组青贮玉米秸秆有氧稳定性

2.5 布氏乳杆菌和纤维素酶对青贮玉米秸秆有氧稳定性的影响

布氏乳杆菌和纤维素酶对发酵青贮玉米秸秆有氧稳定性的影响评价结果如图1 所示，CK 组、LB 组、ENZ 组、LB+ENZ 组青贮玉米秸秆的有氧稳 定 性 时 长 分 别 为89、312、167、367 h，LB+ENZ组、LB 组、ENZ 组青贮玉米秸秆有氧稳定性时间较CK 组分别提高了312.36%、250.56%、87.64%，且各组间差异均显著（P<0.05）。

3 讨论

我国畜牧业发展势头迅猛， 发展过程中存在诸多问题，其中之一是草食家畜粗饲料短缺。我国玉米秸秆资源丰富，易于制作青贮，是家畜较好的饲料来源。为了保存青贮玉米秸秆饲料营养，改善适口性，提高开窖取饲后的有氧稳定性，青贮添加剂必不可少。 随着对青贮饲料发酵品质和有氧稳定性的不断深入研究， 布氏乳杆菌和纤维素酶对青贮发酵效果和有氧稳定性的效果评估成为青贮添加剂研究的热点之一。 赵政等［16］研究发现在青贮玉米秸秆中添加0.3%纤维素酶， 可将腐败率控制在1.4%以下，减少氨态氮含量，降低中性洗涤纤维（NDF）、酸 性 洗 涤 纤 维（ADF）和 酸 性 木 质 素（ADL）含量。 兴丽等［17］研究表明，纤维素酶处理组中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量分别下降5.28%和6.09%， 乳酸菌+纤维素酶处理组酸性洗涤纤维含量下降4.49%， 酸性木质素含量下降8.51%。 Kleinschmit 等［18］研究发现，空白对照组青贮玉米有氧暴露后25 h 开始发霉变质， 而添加105CFU/g 以上布氏乳杆菌组青贮玉米到503 h 才发霉变质， 可见布氏乳杆菌可明显提升青贮玉米的有氧稳定性。美国奶牛和牧草中心研究发现，添加布氏乳杆菌组玉米青贮饲料有氧稳定性比对照组提高100～811 h，可见布氏乳杆菌对青贮饲料有氧稳定性有较大影响［19］。 吕文龙等［15］研究发现布氏乳杆菌可提高青贮玉米秸秆pH 值和乙酸含量，降低乳酸含量及乳酸/乙酸值，提高青贮玉米秸秆的有氧稳定性。

对不同处理组青贮玉米秸秆发酵45 d 后进行感官评价、有机酸含量、微生物含量、水溶性碳水化合物（WSC）含量、营养指标及有氧稳定性等检测， 结果发现添加布氏乳杆菌和纤维素酶可提高青贮玉米秸秆感官评分， 这与其他学者报道结果相似［20-22］。 青贮过程是复杂的微生物代谢变化过程，根据青贮基本原理，在青贮原料中添加布氏乳杆菌使其成为优势菌群， 在厌氧条件下分解游离碳水化合物为有机酸， 纤维素酶通过酶解玉米秸秆中的纤维素， 促进中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维降解， 提高青贮玉米秸秆中的游离碳水化合物含量，为乳酸菌酵解提供更多的糖类。同型发酵乳酸菌则是通过将水溶性糖主要分解为乳酸，提高乳酸生成量及乳酸/乙酸值， 使青贮饲料的pH值迅速下降；而布氏乳杆菌属于异型发酵乳酸菌，能将水溶性糖和乳酸分解产生乙酸、二氧化碳等，降低乳酸含量，产生更多的乙酸，快速降低乳酸/乙酸值，LB 组和LB+ENZ 组均添加了布氏乳杆菌，使布氏乳杆菌快速成为优势菌群，将青贮秸秆中自然附带菌所产乳酸分解转化为乙酸，使LB 组和LB+ENZ 组的pH 值较其他组略高（乳酸pKa=4.14，乙酸pKa=4.75，22.5 ℃）。 而高含量的乙酸可更好地抑制酵母菌及有害微生物的繁殖代谢，但是对于耐酸性能较好的布氏乳杆菌影响不大，可快速成为青贮中的优势菌群， 通过代谢进一步积累青贮中的有机酸，可在短期内使青贮的pH 值下降至4.2 以下， 缩短青贮从储存到进入稳定发酵期的时间， 减少了发酵期间有害微生物繁殖代谢对营养物质的消耗及不良代谢产物的积累（丙酸、丁酸、氨气、霉菌毒素等），最大程度保存玉米秸秆中的各营养成分，提高青贮玉米秸秆的感官品质、发酵品质和有氧稳定性。

4 结论

该研究表明， 在青贮玉米秸秆中添加布氏乳杆菌和纤维素酶可明显降低中性洗涤纤维（NDF）和酸性洗涤纤维（ADF）含量、乳酸/乙酸值、氨态氮（NH3-N）和酵母菌活菌数，增加乙酸含量和水溶性碳水化合物，延长有氧稳定性时间，提高青贮玉米秸秆的感官品质、发酵品质和有氧稳定性。