掺钕钇铝石榴石激光对人滋养层细胞表面抗原2的调控及口腔鳞癌细胞HN6增殖、侵袭和转移的影响

马浩然 龚爱秀 汤根兄，2

1南京医科大学附属儿童医院（南京210008）；2国家卫健委抗体技术重点实验室（南京211166）

口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是分化程度不同、早期可能出现淋巴结转移、手术后容易局部复发的一种恶性肿瘤［1］。OSCC 目前仍采取手术为主的综合治疗，患者口腔手术破坏面部和口腔的解剖结构，患者术后生存质量偏低［2］。因此找到合适的非创伤性辅助治疗方案，尽量减少手术破坏的口腔颌面部组织，提高患者的生存质量尤为重要。

掺钕钇铝石榴石激光（neodymium yttrium-aluminium-garnetm，Nd：YAG）因其具有水吸收率高、杀菌、凝血、对周围组织热损伤小等独特优势显示出较高的医学价值和前景［3-4］。应用于常见的窝洞预备、口腔小手术、牙周炎、种植体周围炎、颌面部血管瘤的治疗等［5-6］。在肿瘤方面有皮肤基底细胞癌的治疗［7］，但在口腔肿瘤方面Nd：YAG 激光的应用暂未见研究。人滋养层细胞表面抗原2（human trophoblast cell-surface antigens 2，TROP2）是一种无内含子的基因，编码323个氨基酸，构成约36 kDa 的细胞表面糖蛋白。其在口腔鳞癌中高表达，且能促进口腔鳞癌细胞的增殖、侵袭与转移，反之亦然［8-9］。但是Nd：YAG 激光能否调控TROP2影响口腔鳞癌细胞的生物学行为尚不清楚。

本实验拟通过体外实验研究Nd：YAG 激光调控TROP2 干预口腔鳞癌细胞的生物学行为，探讨抑制口腔鳞癌细胞HN6 增殖、转移和侵袭的合适激光剂量及可能的作用机制，为激光在口腔鳞癌的辅助治疗方面提供理论依据，以期为临床治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料舌鳞癌细胞株HN6（美国ATCC细胞库）；Nd：YAG 口腔激光治疗仪（KJZ 脉冲）（合肥泓博医学科技有限公司）；CCK-8 试剂（日本同仁公司）；Transwell 小室（美国Corning 公司）；DH5α化学感受态细胞（中国诺唯赞公司）；Lipofectamine 2000 转染试剂（美国Thermo 公司）；兔抗人TROP2单克隆抗体、HRP 标记的羊抗兔IgG 抗体（英国Abcam 公司）。

1.2 实验方法本实验采用160 mJ、5 Hz的激光能量并用同心圆式的照射方法进行照射，使用激光波长为1 064 nm 的KJZ 脉冲Nd：YAG 口腔激光治疗仪，光斑直径2 mm，频率1 ～10 Hz 可调，100 ～250 mJ 能量范围脉冲。实验前测定激光头距离板底部的垂直距离为20 mm。Nd：YAG 激光垂直照射24 孔板，使用激光能量测定仪测定其透过24 孔板的能量，其激光能量稳定为740 mJ/s。

Nd：YAG 照射时间设5 组，分别为0、120、240、360、480 s，对应的激光照射能量密度分别为0 J/cm2（未照射）、44.4 J/cm2（低剂量）、88.8 J/cm2（中剂量1）、133.2 J/cm2（中剂量2）和177.6 J/cm2（高剂量）。

1.3 实验过程

1.3.1 CCK-8增殖实验96孔板中接种细胞悬液，每组设3 个复孔，四周加入PBS 溶液防止水分蒸发，将培养板置于培养箱中培养24、48 h（37 ℃，5%CO2）。弃去原有培养基，向培养板每孔中加入10 μL CCK-8 试剂，在培养箱中继续培养2 ～3 h，酶标仪检测450 nm 处吸光度，实验重复3 次。

1.3.2 细胞划痕试验HN6 细胞按不同剂量照射后进行划痕，用200 μL 无菌枪头比对直尺，垂直于孔板底细胞划痕，枪头划痕要求直，洗去划下的漂浮细胞，将其加入无血清DMEM 培养基后置于37 ℃、5% CO2培养箱中继续培养，倒置显微镜下观察细胞在培养0、12、24、48 h 后划痕宽度的变化，分组拍照记录，利用Image J 软件来测量划痕区的像素定量比较各组细胞划痕愈合的能力。同等条件下，实验独立重复3 次。

1.3.3 Transwell侵袭实验预冷的枪头吸入100 μL Matrigel 胶加到500 μL 无血清培养基，稀释至终浓度为1 mg/mL。在Transwell 小室底部中央垂直加入100 μL 稀释后的Matrigel 胶。无血清的DMEM培养基将五组激光照射后HN6 细胞制成细胞悬液，Transwell 的上室中加入细胞悬液200 μL，下室中加入含10%FBS 的500 μL 培养基。将其放于37 ℃、5% CO2环境中孵育48 h。去除Transwell 小室内培养液，棉签擦去上室中未穿过的细胞和Matrigel 胶，95%的甲醇对细胞进行固定后使用0.1%结晶紫避光染色5 s。随机取5 个高倍镜视野取平均值。显微镜下观察穿过微孔移到滤膜下层的细胞总数，以穿过膜底的细胞数来代表肿瘤细胞的侵袭能力。实验独立重复3 次，取平均数为实验结果。

1.3.4 荧光定量PCR（qRT-PCR）应用Trizol试剂提取细胞总RNA，根据说明书步骤使用SuperScript IV First-Strand 试剂盒将RNA 逆转录为cDNA。扩增条件：95 ℃预热10 min，95 ℃变性15 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循环30 次；72 ℃10 min。引物序列如下：TROP2，上游5′-TGTCCTGATGTGATATGTCTGAG-3′，下游5′-GGGTGAGAGTGGGTTGGG-3′；GAPDH，上游5-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，下游5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。以GAPDH 为参照基因，计算TROP2 相对定量值2-△△Ct。实验均重复3 次。

1.3.5 免疫印迹法（Western blot）每1×106个细胞加入100 μL RIPA裂解液，摇匀置于冰上30 min，每隔10 min 来回摇动EP 管，使细胞充分裂解。4 ℃下，12 000 r/min，离心5 min，取上清液转移到另一EP 管中，4 ℃，12 000 r/min，离心10 min，取上清液与蛋白上样缓冲液混合，95 ℃加热10 min，-20 ℃保存。聚丙烯酰胺凝胶电泳将蛋白质样品进行分离并转移至PVDF 膜。室温下5 %脱脂牛奶封闭2 h，4 ℃兔抗人TROP2单克隆抗体（1∶2 000）孵育过夜。PBST 漂洗三次后HRP 标记的羊抗兔IgG 抗体（1∶2 000）孵育1 h。ECLA 液和B 液按1∶1 比例混合，完全覆盖PVDF 膜，采用ChemiDoc XRS 曝光软件拍照后采用Image-Pro Plus 6.0 软件检测其灰度值。

1.3.6 TROP2敲减质粒的构建与鉴定通过NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov）查询TROP2 基因所有序列，根据TROP2 基因序列设计TROP2 shRNA 序列，序列为：gtgtcccaccaacaagatgac，敲减质粒以下称为shTROP2。TROP2 敲减质粒的构建由广州Gene-Copoeia 公司完成。将质粒转化至DH5α感受态细胞，加入800 μL不含氨苄青霉素的LB 液体培养基，于37 ℃摇床培养60 min，200 r/min，离心3 min，取上清加入到含氨苄青霉素溶液（100 μg/mL）LB 固体培养基平板上，37 ℃的培养箱中倒置培养过夜。24 h 后挑取菌落放于1 mL 含氨苄青霉素溶液的LB 培养基中，37 ℃摇菌，次日将菌液与10 %的甘油混匀后保存于-80 ℃备用。部分菌落送南京金斯瑞生物公司测序，并根据质粒制备试剂盒说明来提取及纯化质粒。

1.3.7 细胞转染将细胞接种至六孔板内。待细胞汇合度为90% ～95%时，将4 μg 质粒DNA 加至250 μL 的OPTI-MEM 培基中，混匀。将10 μL 的Lipo2000 加至另外250 μL 的OPTI-MEM 中，轻轻混匀，室温静置5 min。将DNA 悬液和Lipo2000 悬液混合，总体积500 μL，轻轻混匀，室温静置20 min。将DNA 和Lipo2000 混合液加至六孔板的孔内，前后左右晃动孔板混匀，置于培养箱中培养。转染4～6 h 后，细胞换液，每孔2 mL 培养基。

1.4 统计学方法采用SPSS 19.0 统计软件进行统计学分析，计量资料以（）表示，组间方差齐时采用单因素方差分析，不齐时则采用非参数检验，以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 激光照射对HN6 细胞增殖能力的影响在相同照射时间下，低剂量组、中剂量组相对于未照射组的HN6 细胞增殖受到抑制，差异有统计学意义（P＜0.05）；高剂量组相对于未照射组，HN6 细胞的增殖能力增强，差异有统计学意义（P＜0.05，图1）。

图1 CCK-8 实验结果Fig.1 The results of CCK-8 experiment

2.2 激光照射对HN6 细胞转移影响24、48 h 两个时间点检测四组不同剂量激光照射细胞后划痕，低剂量组和中剂量组划痕宽度小于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。高剂量组划痕宽度明显大于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。随照射时间间隔的增加，划痕宽度差异增大（表1、图2）。

表1 HN6 细胞各组各时刻的划痕宽度Tab.1 The scratch width of HN6 cells in different groups and time±s

表1 HN6 细胞各组各时刻的划痕宽度Tab.1 The scratch width of HN6 cells in different groups and time±s

0 h 24 h 48 h 0 J/cm2（0 s）235.5±4.6 189.5±15.3 145.8±9.5 44.4 J/cm2（120 s）231.5±5.7 102.1±12.3 58.0±20.1 88.8 J/cm2（240 s）234.1±4.1 105.9±10.3 68.1±19.3 133.2 J/cm2（360 s）232.3±4.7 105.1±9.9 60.2±21.0 177.6 J/cm2（480 s）236.0±5.2 225.5±4.4 209.9±5.6

不同照射剂量下，细胞划痕在0、24、48 h 时间点，三组两两之间差异具有统计学意义（P＜0.05）。相同划痕时间下，低剂量vs.中剂量组与对照组vs.高剂量组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05）；而高剂量组与对照组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05）；低剂量组与中剂量组相比，差异无统计学意义（P＞0.05，图3）。结果表明，低剂量和中剂量激光照射后促进细胞转移，高剂量激光照射后，细胞转移受到抑制。

2.3 激光照射对HN6 细胞侵袭的影响倒置显微镜下观察，44.4、88.8、133.2 J/cm2照射组与未照射组对比，细胞数量增多且密度增大；177.6 J/cm2组照射后，细胞数量减少、密度降低（图4、5）。

2.4 激光照射对HN6细胞TROP2表达的影响激光照射HN6 细胞480 s 后，qRT-PCR 检测HN6 细胞中TROP2 的mRNA 表达水平，低剂量组和中剂量组TROP2 的mRNA 水平高于对照组，高剂量组低于未照射组，差异有统计学意义（P＜0.05，图6）。Western blot 在蛋白水平上验证了TROP2 的表达变化，低剂量组和中剂量组TROP2蛋白水平高于未照射组，高剂量组低于未照射组，差异有统计学意义（P＜0.05，图7、8）。

图2 HN6 细胞划痕实验结果Fig.2 The results of HN6 cell scratch experiment

图3 HN6 细胞各组各时刻的划痕宽度柱形图Fig.3 The bar charts of the scratch width in different groups and time of HN6 cells

2.5 抑制TROP2 表达对激光照射后细胞增殖与侵袭的影响CCK-8 实验表明，不同剂量激光照射对转染shTROP2 的HN6 细胞增殖的影响无差异（P＞0.05，图9）。Transwell 实验表明，不同剂量激光照射组中HN6 细胞侵袭性差异消失（P＞0.05，图10）。

3 讨论

口腔鳞癌是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤之一，5 年生存率仅约50%［10-11］。目前口腔鳞癌的治疗主要是采取以手术为主的综合序列治疗［12-13］，包括手术治疗、化学治疗、放射治疗、靶向治疗或综合序列治疗等［14-15］，当前的治疗方式虽然提高口腔鳞癌患者的5 年存活率，但仍然约30%的患者因局部复发或转移而导致治疗失败［16-17］。因此，非侵入性、非创伤性的治疗方式已成为口腔癌辅助治疗的方向，优化的治疗方式亟需进一步研究并应用于临床。

图4 细胞侵袭实验结果Fig.4 Results of cell invasion experiment

图5 细胞侵袭实验各组对比柱形图Fig.5 The bar charts of cell invasion test groups

图6 qRT-PCR 检测各组细胞中TROP2 mRNA 表达Fig.6 TROP2 mRNA expression in each group was detected by qRT-PCR

图7 Western blot 检测各组细胞中TROP2 蛋白表达Fig.7 TROP2 protein expression in each group was detected by Western blot

图8 Western blot 检测各组细胞中TROP2 蛋白表达的灰度统计图Fig.8 Gray-scale statistical image of TROP2 protein expression in each group was detected by Western blot

图9 CCK-8 检测转染干扰质粒后各组细胞增殖情况Fig.9 Cell proliferation in each group was detected by CCK-8 after transfection with interfering plasmids

图10 Transwell实验检测转染干扰质粒后各组细胞侵袭情况Fig.10 Cell invasion in each group was detected by Transwell assay after transfection with interfering plasmids

Nd：YAG激光属于近红外激光，波长为1 064 nm，分为连续式和脉冲式两种［18］，能分散或渗透到生物组织中［19］，Nd：YAG 激光具有选择性光热作用，能减少对周围正常组织的热损伤［20］，减轻瘢痕等不良反应的发生，且其具备高效的软硬组织切割能力和止血杀菌作用，已被广泛运用到口腔治疗中［21］。本研究首次通过不同剂量激光调控TROP2作用于口腔鳞癌细胞以探讨抑制口腔鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭的合适激光剂量及可能的作用机制，为口腔鳞癌的辅助治疗提供一定的理论基础。

本实验通过研究口腔鳞癌细胞在不同剂量Nd：YAG 激光照射下的增殖、迁移和侵袭情况，寻找对抑制口腔鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭的有效剂量。细胞增殖实验结果显示，相同照射时间下的低剂量组、中剂量组相对于对照组促进HN6 细胞增殖，高剂量组相对于对照组抑制HN6 细胞增殖。划痕实验结果发现，相同照射时间下，低剂量组和中剂量组划痕宽度小于对照组，高剂量组划痕宽度大于对照组，且随照射时间间隔的增加，划痕宽度差异增大。侵袭实验结果发现，镜下观察低剂量和中剂量激光照射后细胞穿膜数量增多，侵袭能力提高，高剂量激光照射后穿膜数量减少，侵袭能力受到抑制。结果说明，不同剂量的Nd：YAG 激光对口腔鳞癌细胞HN6 的生物学行为影响不一，选择合适剂量的Nd：YAG 激光能对口腔鳞癌细胞的增殖、迁移与侵袭产生抑制作用，有助于作为无创伤性的治疗手段辅助治疗口腔鳞癌。

TROP2在实体肿瘤细胞中普遍高表达，可以促进细胞的异常增殖，还参与了多种肿瘤的侵袭和转移，并与预后有关［22-23］。本研究发现低剂量组和中剂量组的激光照射能够促进细胞中的TROP2 表达，高剂量激光照射可抑制细胞的TROP2 表达。干扰TROP2表达后，低剂量组和中剂量组激光照射对口腔鳞癌细胞增殖和侵袭的促进作用消失。上述研究结果表明，Nd：YAG 激光可以通过调控TROP2的表达影响口腔鳞癌细胞的增殖、侵袭与转移。

目前研究发现，Nd：YAG 激光有效穿透深度约4 mm，对于＜4 mm 的口腔鳞癌组织可起到治疗作用，但尚不能对＞4 mm 深度的口腔鳞癌组织进行有效的治疗，但是可考虑作为术前辅助治疗，从肿瘤周围正常组织0.5 ～1.0 cm 先照射，逐渐移向中心［24-25］，使后期手术适当缩小肿瘤直径，保留一些合适的组织，尽可能的减少患者的面容破坏，提高患者的生存质量。

综上所述，不同剂量的Nd：YAG 激光对口腔鳞癌细胞HN6 进行照射时，较小剂量的Nd：YAG激光在一定剂量范围内促进HN6 细胞的增殖、迁移和侵袭；较高剂量的Nd：YAG 激光在一定剂量范围内有抑制鳞癌细胞HN6 增殖、迁移和侵袭，Nd：YAG 激光通过调节TROP2 干预口腔鳞癌细胞HN6 的增殖与侵袭。后期将增加口腔鳞癌细胞的种类并加入TROP2 干预进一步研究适宜的激光剂量，在不改变细胞形态的基础上，以期能对口腔鳞癌细胞的增殖、迁移、侵袭和分子机制方面提供更加科学的理论依据，并应用于指导临床上Nd：YAG 激光治疗和免疫治疗的安全操作。