小黄皮茎的化学成分及生物活性研究

夏红旻，曲延伟，王 亮，郭 威，张东明*

1.山东省中医药研究院 泰山学者特聘专家岗位 国家中医药管理局中药分析重点学科 山东省中药质量标准研究重点实验室，山东 济南 250014

2.北京协和医学院 中国医学科学院药物研究所 天然药物活性物质与功能国家重点实验室，北京 100050

3.山东达冠医药科技有限公司，山东 济南 250101

小黄皮Clausena e marginataHuang 是芸香科（Rutaceae）黄皮属ClausenaBurm.f.小乔木，分布于云南、广西、海南等地。其根、叶均可入药，具有宣肺止咳、通经活络、行气止痛等功效，用于感冒头痛、风寒咳嗽、胃痛及风湿性关节炎等症的治疗[1]。前期本课题组从小黄皮茎枝95%乙醇提取物的氯仿部位分离到了一系列的柠檬苦素、生物碱、香豆素及木脂素类化合物，并对其进行了多模型药理活性评价，结果表明部分化合物具有良好的抗炎、保肝等活性[2-6]。为继续寻找结构新颖、活性强的单体化合物，为小黄皮的临床应用及资源的合理开发利用提供理论支持，本课题组从其95%乙醇提取物的氯仿部位分离得到11 个化合物，分别鉴定为nordentatin（1）、oxanordentatin（2）、5′-羟基葡萄内酯（anisocoumarin H，3）、7-[(E)-7′-羟基-3′,7′-二甲基-2′,5′-二烯]-香豆素（7-[(E)-7′-hydroxy-3′,7′-dimethylocta-2′,5′-dienyloxy]-coumarin，4）、7-羟基香豆素（7-hydroxycoumarin，5）、claulamine A（6）、γ-崖椒碱（γ-fagarine，7）、开环异落叶松脂素（secoisolariciresinol，8）、2-{4-[(1E)-3-hydroxyprop-1-en-1-yl]-2,6-dimethoxyphenoxy}propane-1,3-diol（9）、2-[4-(3-hydroxy-1-propenyl)-2-methoxyphenoxy]-1,3-propanediol（10）、甲基-2-O-β-D-吡喃葡萄糖基苯甲酸（methyl 2-O-β-D-glucopyranosylbenzoate，11）。其中，化合物1～5 为香豆素类化合物，6 为咔唑生物碱，7 为呋喃喹啉类生物碱，8 为木脂素类化合物，9、10 为苯丙素类化合物，11 为酚酸类化合物。化合物2～4、7～11 为首次从该植物中分离得到。在化合物体外活性评价中，化合物5 和7对DL-半乳糖胺诱导的WB-F344细胞损伤具有一定的保护活性，化合物11 对LPS 诱导BV2 细胞产生NO 具有一定的抑制作用。

1 仪器与材料

Mercury-400 型（美国Varian 公司）；Bruker AV500-III 型核磁共振仪（德国Bruker 公司）；Agilent 1100 Series LC-MSD-Trap-SL 型质谱仪（安捷伦科技有限公司）；中压制备液相色谱系统（瑞士布琪有限公司）；Shimadzu LC-6AD 型半制备液相色谱仪（日本岛津公司）；制备柱（YMC ODS-A C18，250 mm×20 mm，5 μm，日本YMC 公司）；薄层色谱硅胶GF254和柱色谱硅胶（100～200、200～300 目，青岛海洋化工有限公司）；色谱纯溶剂（美国Fisher公司）；分析纯试剂（国药集团化学试剂有限公司）。

小黄皮药材于2010年8月采自云南西双版纳，经中国科学院西双版纳热带植物园崔景云研究员鉴定为小黄皮C.emarginataHuang 的干燥茎枝，标本（ID-22254）存放于中国医学科学院药物研究所标本室。

2 提取与分离

小黄皮茎18 kg，经干燥、粉碎后，用95%乙醇加热回流提取3 次（每次2 h），减压浓缩至无醇味，得提取物570 g。提取物经硅藻土柱色谱分离，依次用石油醚、氯仿、醋酸乙酯、丙酮、丙酮-乙醇（1∶1）、乙醇、乙醇-水（1∶1）进行洗脱，分成7个部位。氯仿洗脱部位（81 g）用硅胶柱色谱（200～300 目）分离，以石油醚-丙酮（100∶0、9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5）进行梯度洗脱，得到6 个部位（A1～A6）。其中A3（15 g）采用硅胶柱色谱（200～300 目）粗分，以石油醚-丙酮（100∶0、95∶5、9∶1、85∶15、8∶2、75∶25、7∶3、65∶35、6∶4、55∶45、5∶5）为洗脱剂梯度洗脱，根据薄层色谱分析结果，将相同组分合并后得到5 个组分（A3B1～A3B5）。组分A3B1（4.0 g）先经MPLC分离（30%～90%甲醇，25 mL/min，4 h），再经制备型HPLC 纯化（40%甲醇，8 mL/min），得到化合物1（45 mg）、2（0.8 mg）、3（4.2 mg）、4（8.3 mg）、5（9.5 mg）和6（15 mg）。A3B2（2.8 g）通过MPLC进行粗分（30%～90%甲醇，25 mL/min，3 h），然后用制备型HPLC 分离纯化，38%甲醇溶液为流动相（8 mL/min），得到化合物7（5 mg）。A5（8.1 g）先用硅胶柱色谱分离，以石油醚-丙酮（100∶0→5∶5）为洗脱剂，根据薄层色谱分析结果，将相同组分合并，得到2 个组分（A5B1～A5B2）。组分A5B1（3.2 g）经过MPLC 粗分（10%～90%甲醇，25 mL/min，3 h），再用制备型HPLC 分离（35%甲醇，8 mL/min），得到化合物8（3 mg）。组分A5B2（2.8 g）先用MPLC 分离，10%～90%甲醇为流动相（25 mL/min，3 h），再经制备型HPLC 纯化（35%甲醇，8 mL/min），得到化合物9（4 mg）、10（7 mg）和11（4 mg）。

3 结构鉴定

化合物1：淡黄色粉末；ESI-MSm/z335.1[M＋Na]＋。1H-NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ: 6.11 (1H,d,J= 9.6 Hz,H-3),8.11 (1H,d,J= 9.6 Hz,H-4),5.71(1H,d,J= 10.0 Hz,H-3′),6.70 (1H,d,J= 10.0 Hz,H-4′),6.22 (1H,dd,J= 17.6,10.8 Hz,H-2′′),4.82(2H,dd,J= 17.6,10.8 Hz,H-3′′),1.56 (6H,s,2′-CH3),1.37 (6H,s,1′′-CH3)；13C-NMR (125 MHz,DMSO-d6)δ: 159.9 (C-2),109.5 (C-3),140.2 (C-4),106.6 (C-4a),148.4 (C-5),104.1 (C-6),155.5 (C-7),113.8 (C-8),153.7 (C-8a),76.8 (C-2′),128.5 (C-3′),116.6 (C-4′),40.4 (C-1′′),150.0 (C-2′′),107.9 (C-3′′),27.0 (2′-CH3),29.5 (1′′-CH3)。以上数据与文献报道基本一致[7]，故鉴定化合物1 为nordentatin。

化合物2：淡黄色粉末；ESI-MSm/z329.2 [M＋H]＋；1H-NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ: 6.12 (1H,d,J= 9.6 Hz,H-3),7.93 (1H,d,J= 9.6 Hz,H-4),5.73(1H,d,J= 10.0 Hz,H-3′),6.40 (1H,d,J= 10.0 Hz,H-4′),4.41 (1H,dd,J= 6.4,5.2 Hz,H-2′′),3.74 (2H,m,H-3′′),1.42 (6H,s,2′-CH3),1.50 (3H,s,1′′-CH3),1.26 (3H,s,1′′-CH3)；13C-NMR (125 MHz,DMSO-d6)δ: 159.8 (C-2),109.9 (C-3),139.2 (C-4),103.0 (C-4a),149.8 (C-5),101.4 (C-6),157.5 (C-7),113.9 (C-8),150.4 (C-8a),78.0 (C-2′),128.8 (C-3′),115.1 (C-4′),42.9 (C-1′′),94.4 (C-2′′),59.6 (C-3′′),27.6 (2′-CH3),27.5 (2′-CH3),26.4 (1′′-CH3),20.8 (1′′-CH3)。以上数据与文献报道基本一致[8]，故鉴定化合物2 为oxanordentatin。

化合物3：淡黄色粉末；ESI-MSm/z337.3 [M＋Na]＋；1H-NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ: 6.27 (1H,d,J= 9.6 Hz,H-3),7.98 (1H,d,J= 9.6 Hz,H-4),7.60(1H,d,J= 8.8 Hz,H-5),6.92 (1H,dd,J= 8.8,2.0 Hz,H-6),6.96 (1H,s,H-8),4.63 (2H,d,J= 6.8 Hz,H-1′),5.41 (1H,t,J= 6.4 Hz,H-2′),2.19 (1H,dd,J= 13.2,7.2 Hz,H-4′a),2.02 (1H,dd,J= 13.2,6.0 Hz,H-4′b),4.45 (1H,m,H-5′),5.05 (1H,d,J= 8.4 Hz,H-6′),1.57 (3H,s,H-8′),1.72 (3H,s,3′-CH3),1.56 (3H,s,7′-CH3)；13C-NMR (125 MHz,DMSO-d6)δ: 160.4(C-2),113.0 (C-3),144.4 (C-4),112.4 (C-4a),129.5(C-5),112.3 (C-6),161.7 (C-7),101.4 (C-8),155.4(C-8a),65.7 (C-1′),120.9 (C-2′),138.8 (C-3′),47.8(C-4′),65.2 (C-5′),129.5 (C-6′),131.4 (C-7′),25.5(C-8′),17.1 (3′-CH3),18.0 (7′-CH3)。以上数据与文献报道基本一致[9]，故鉴定化合物3 为5′-羟基葡萄内酯。

化合物4：淡黄色油状物；ESI-MSm/z337.2[M＋Na]＋；1H-NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ: 6.27(1H,d,J= 9.6 Hz,H-3),7.97 (1H,d,J= 9.6 Hz,H-4),7.60 (1H,d,J= 8.4 Hz,H-5),6.94 (1H,dd,J= 8.4,2.0 Hz,H-6),6.99 (1H,d,J= 2.0 Hz,H-8),4.65 (2H,d,J= 6.4 Hz,H-1′),5.46 (1H,t,J= 6.8 Hz,H-2′),2.71(2H,d,J= 6.8 Hz,H-4′),5.50 (1H,dt,J= 15.6,6.4 Hz,H-5′),5.58 (1H,d,J= 15.6 Hz,H-6′),1.14 (3H,s,H-8′),1.70 (3H,s,3′-CH3),1.14 (3H,s,7′-CH3)；13C-NMR (125 MHz,DMSO-d6)δ: 160.3 (C-2),112.9(C-3),144.4 (C-4),112.4 (C-4a),129.4 (C-5),112.3(C-6),161.7 (C-7),101.4 (C-8),155.4 (C-8a),65.2(C-1′),119.2 (C-2′),141.5 (C-3′),41.4 (C-4′),122.2(C-5′),140.6 (C-6′),68.8 (C-7′),30.1 (C-8′),16.5(3′-CH3),30.1 (7′-CH3)。以上数据与文献报道基本一致[10]，故鉴定化合物4 为7-[(E)-7′-羟基-3′,7′-二甲基-2′,5′-二烯]-香豆素。

化合物5：黄色粉末；ESI-MSm/z185.1 [M＋Na]＋；1H-NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ: 6.16 (1H,d,J= 9.2 Hz,H-3),7.90 (1H,d,J= 9.6 Hz,H-4),7.49(1H,d,J= 8.0 Hz,H-5),6.75 (1H,dd,J= 8.4,1.6 Hz,H-6),6.67 (1H,d,J= 0.8 Hz,H-8)；13C-NMR (125 MHz,DMSO-d6)δ: 161.9 (C-2),113.3 (C-3),144.5(C-4),111.0 (C-4a),129.6 (C-5),111.0 (C-6),160.5(C-7),102.2 (C-8),155.6 (C-8a)。以上数据与文献报道基本一致[11]，故鉴定化合物5 为7-羟基香豆素。

化合物6：白色粉末；ESI-MSm/z306.2 [MH]-；1H-NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ: 8.59 (1H,brs,H-4),8.23 (1H,d,J= 8.0 Hz,H-5),7.22 (1H,t,J=7.6 Hz,H-6),7.44 (1H,t,J= 8.0 Hz,H-7),7.55 (1H,d,J= 8.0 Hz,H-8),3.28 (1H,dd,J= 16.0,3.0 Hz,H-1′a),3.16 (1H,dd,J= 16.4,10.8 Hz,H-1′b),5.05(1H,overlapped,H-2′),5.15 (1H,s,H-4′a),5.03 (1H,s,H-4′b),1.86 (3H,s,H-5′),3.95 (3H,s,1-OCH3),11.84 (1H,brs,NH)；13C-NMR (125 MHz,DMSO-d6)δ: 140.7 (C-1),136.2 (C-1a),116.0 (C-2),127.6 (C-3),119.0 (C-4),123.5 (C-4a),120.8 (C-5),122.9 (C-5a),119.9 (C-6),126.6 (C-7),111.7 (C-8),140.6 (C-8a),26.1 (C-1′),80.0 (C-2′),142.6 (C-3′),113.4 (C-4′),18.3 (C-5′),60.9 (1-OCH3),165.4 (3-C=O)。以上数据与文献报道基本一致[12]，故鉴定化合物 6 为claulamine A。

化合物7：白色粉末；ESI-MSm/z252.0 [M＋Na]＋；1H-NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ: 8.05 (1H,d,J= 2.4 Hz,H-2),7.46 (1H,d,J= 2.8 Hz,H-3),7.75(1H,d,J= 8.8 Hz,H-5),7.37 (1H,t,J= 8.0 Hz,H-6),7.16 (1H,d,J= 7.6 Hz,H-7),4.43 (3H,s,4-OCH3),3.94 (3H,s,8-OCH3)；13C-NMR (125 MHz,DMSO-d6)δ: 144.6 (C-2),105.3 (C-3),103.5 (C-3a),156.2 (C-4),113.5 (C-5),123.6 (C-6),108.4 (C-7),154.3 (C-8),162.6 (C-9a),59.4 (4-OCH3),55.6 (8-OCH3)。以上数据与文献报道基本一致[13]，故鉴定化合物7 为γ-崖椒碱。

化合物8：白色粉末；ESI-MSm/z385.1 [M＋Na]＋；1H-NMR (400 MHz,methanol-d4)δ: 6.53 (2H,brs,H-2,2′),6.60 (2H,d,J= 8.0 Hz,H-5,5′),6.49(2H,d,J= 8.0 Hz,H-6,6′),2.60 (2H,dd,J= 13.6,6.8 Hz,H-7a,7′a),2.50 (2H,dd,J= 13.6,8.8 Hz,H-7b,7′b),1.84 (2H,m,H-8,8′),3.53 (4H,m,H-9a,9b,9′a,9′b),3.68 (6H,s,3,3′-OCH3)。以上数据与文献报道基本一致[14]，故鉴定化合物8 为开环异落叶松脂素。

化合物9：白色粉末；ESI-MSm/z307.0 [M＋Na]＋；1H-NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ: 6.76 (2H,brs,H-2,6),6.47 (1H,d,J= 16.0 Hz,H-7),6.33 (1H,dt,J= 16.0,4.8 Hz,H-8),4.33 (2H,m,H-9),3.55(4H,m,H-1′,3′),3.84 (1H,m,H-2′),3.77 (6H,s,3,5-OCH3)；13C-NMR (125 MHz,DMSO-d6)δ: 132.3(C-1),103.3 (C-2),152.8 (C-3),134.8 (C-4),152.8(C-5),103.3 (C-6),128.3 (C-7),130.0 (C-8),61.2(C-9),59.8 (C-1′),83.2 (C-2′),59.8 (C-3′),55.8 (3,5-OCH3)。以上数据与文献报道基本一致[15]，故鉴定化合物9 为2-{4-[(1E)-3-hydroxyprop-1-en-1-yl]-2,6-dimethoxyphenoxy}propane-1,3-diol。

化合物10：白色粉末；ESI-MSm/z277.0 [M＋Na]＋；1H-NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ:7.02 (1H,brs,H-2),6.88 (1H,d,J= 8.4 Hz,H-5),6.97 (1H,d,J= 8.4 Hz,H-6),6.45 (1H,d,J= 16.0 Hz,H-7),6.24(1H,dt,J= 15.6,5.2 Hz,H-8),4.71 (2H,t,J= 5.6 Hz,H-9),3.55 (4H,m,H-1′,3′),4.14 (1H,m,H-2′),3.76(3H,s,3-OCH3)；13C-NMR (125 MHz,DMSO-d6)δ:130.2 (C-1),109.6 (C-2),149.6 (C-3),146.8 (C-4),115.5 (C-5),118.8 (C-6),128.3 (C-7),128.5 (C-8),61.4 (C-9),60.0 (C-1′),80.7 (C-2′),60.0 (C-3′),55.3(3-OCH3)。以上数据与文献报道基本一致[16]，故鉴定化合物 10 为 2-[4-(3-hydroxy-1-propenyl)-2-methoxyphenoxy]-1,3-propanediol。

化合物11：白色粉末；ESI-MSm/z337.1 [M＋Na]＋；1H-NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ: 7.25 (1H,d,J= 8.4 Hz,H-4),7.08 (1H,t,J= 7.6 Hz,H-5),7.51(1H,t,J= 8.4 Hz,H-6),7.62 (1H,d,J= 7.6 Hz,H-7),4.89 (1H,d,J= 6.8 Hz,H-1′),3.15～3.26 (4H,m,H-2′～5′),3.69 (1H,dd,J= 11.2,4.8 Hz,H-6′a),3.57(1H,m,H-6′b),3.79 (3H,s,1-COOCH3)；13C-NMR(125 MHz,DMSO-d6)δ: 166.2 (C-1),121.0 (C-2),155.9 (C-3),116.1 (C-4),133.1 (C-5),121.4 (C-6),130.1 (C-7),100.7 (C-1′),73.1 (C-2′),76.3 (C-3′),69.4(C-4′),76.9 (C-5′),60.4 (C-6′),51.8 (1-COOCH3)。以上数据与文献报道基本一致[17]，故鉴定化合物11 为甲基-2-O-β-D-吡喃葡萄糖基苯甲酸。

4 活性筛选

4.1 保肝活性筛选

将WB-F344 细胞置于DMEM 培养基（含10%新生牛血清，100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素，pH 值为7.2～7.4），在37 ℃、5% CO2下生长。以培养基将细胞分散，使成为密度为1×105个/mL 的细胞悬液，以每孔0.1mL 接种于96 孔板。将细胞分为4 组，即对照组、模型组、实验组和阳性对照组，24 h 后，实验组加入待测单体化合物（1～11），阳性对照组加入阳性对照药双环醇，给药浓度均为10 μmol/L，1 h 后，除对照组外，其余各组分别加入DL-半乳糖胺，终浓度为50 mmol/L。继续培养24 h 后换含有MTT（0.5 mg/mL）无血清的培养基，培养4 h，吸取培养液，加入DMSO 振荡使溶解，于490 nm 下测定吸光度（A）值。研究结果显示，化合物5 和7 对DL-半乳糖胺诱导的WB-F344 细胞损伤具有一定的保护活性，在浓度为10 μmol/L 时肝细胞的存活率分别为49%和48%，与模型组比较差异具有显著性，结果见表1。

细胞存活率=(A实验－A空白基质)/(A对照－A空白基质)

4.2 抗炎活性筛选

将BV2 细胞置于DMEM-F12 培养基（含10%新生牛血清），在37 ℃、5% CO2、100%相对湿度下生长。将其接种到96 孔板中（2×104个/孔），并分为4 组，即对照组、模型组、实验组和阳性对照组，24 h 后，实验组加入不同浓度的受试化合物（1～11），阳性对照组加入不同浓度的阳性药姜黄素（10.0、1.0、0.1 μmol/L，每个浓度3 个平行孔），1 h后，除对照组外，其余各组分别加入LPS（终质量浓度为300 ng/mL），继续培养24 h，收集培养基上清100 μL，加入等体积Griess 试剂，室温静置20 min，蒸馏水调零，于酶标仪上测定540 nm 处A值，以所测样品中NO2-的浓度来反映NO 的浓度。结果显示，化合物11 对LPS 诱导的BV2 细胞释放NO具有较好的抑制活性，其半数抑制浓度（IC50）值为8.5 μmol/L，其他化合物的IC50值均大于10 μmol/L，阳性对照姜黄素的IC50值为0.5 μmol/L。

表1 化合物5 和7 对DL-半乳糖胺诱导的肝细胞损伤的保护作用Table 1 Hepatoprotective effects of compounds 5 and 7 against DL-galactosamine-induced toxicity in WB-F344 cells

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突