HPLC法同时测定春血安胶囊中8种成分的含量

翟英英，位恒超(.河南中医药大学第三附属医院药学部，郑州 450008；.河南中医药大学，郑州 450000)

中药及其制剂是经数千年传承与发展的产物，其临床疗效已得到了广大医患的认可。春血安胶囊是由熟地黄、盐车前子、肉桂、泽泻和柴胡等13味中药制成的中成药复方制剂，主治肝肾不足、冲任失调所致的月经失调、崩漏和痛经，症见经行错后、经量多或淋漓不净、经行小腹冷痛、腰部疼痛，青春期功能失调性子宫出血、上节育环后出血见上述证候患者[1]。中成药复方制剂具有多组分、多靶点和整体作用的特点，通过各成分相互作用，达到临床治疗的效果，降低不良反应，多指标成分质量控制模式近年来已逐步应用于中药及其制剂中。春血安胶囊现行质量标准[1]和文献报道[2]中仅对佐药黄连所含的盐酸小檗碱和盐酸巴马汀进行了定量控制，未对处方中君药和其他药材所含成分进行研究，本实验选取方中熟地黄和盐车前子[3]所含活性成分毛蕊花糖苷和焦地黄苯乙醇苷B1，肉桂所含特征成分肉桂酸和桂皮醛，泽泻[4]所含代表性成分泽泻醇F、泽泻醇A、24-乙酰泽泻醇A和23-乙酰泽泻醇B为检测指标，建立能同时测定春血安胶囊中8种成分含量的HPLC法，为更加全面地评价春血安胶囊的质量提供依据。

1 仪器与试药

1.1仪器 Ulti Mate3000型高效液相色谱仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)；CPA225D型电子天平(德国Sartorius公司)；KQ-500E型台式超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2试药 毛蕊花糖苷(批号111530-201914，CAS号：61276-17-3，质量分数为95.2%)、肉桂酸(批号110786-201604，CAS号：140-10-3，质量分数为98.8%)、桂皮醛(批号110710-201821，CAS号：14371-10-9，质量分数为99.6%)和23-乙酰泽泻醇B对照品(批号111846-201705，CAS号：26575-95-1，质量分数为99.7%)，均购于中国食品药品检定研究院；焦地黄苯乙醇苷B1对照品(批号CFS201802，CAS号：120406-37-3，质量分数为98.0%)，购于武汉天植生物技术有限公司；泽泻醇F(批号PRF9041322，CAS号：155521-45-2，质量分数为98.0%)和24-乙酰泽泻醇A对照品(批号PRF8050342，CAS号：18674-16-3，质量分数为99.6%)，均购自成都普瑞法科技开发有限公司；泽泻醇A对照品(批号15071422，CAS号：19885-10-0，质量分数为97.9%)，购自上海同田生物技术股份有限公司。乙腈为色谱纯(国药集团化学试剂有限公司)，其他试剂均为分析纯。春血安胶囊(规格：每粒0.5 g，批号：A08004，A08007，A08012)，均购于天津宏仁堂药业有限公司。

2 方法与结果

2.1色谱条件 色谱柱：Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱温：25 ℃。乙腈(A)-1 mL·L-1磷酸(B)，梯度洗脱(0～8.0 min，15.0%A；8.0～14.0 min，15.0%A～22.0%A；14.0～25.0 min，22.0%A～52.0%A；25.0～43.0 min，52.0%A～78.0%A；43.0～50.0 min，78.0%A～15.0%A)。流速：0.8 mL·min-1；进样量：10 μL；检测波长分别为330(0～14.0 min检测毛蕊花糖苷和焦地黄苯乙醇苷B1)[5-15],280(14.0～25.0 min检测肉桂酸和桂皮醛)[16-18]和208 nm(25.0～50.0 min检测泽泻醇F、泽泻醇A、24-乙酰泽泻醇A和23-乙酰泽泻醇B)[19-21]。

2.2溶液的配制

2.2.1混合对照品溶液 精密称取8种成分对照品各适量，用甲醇制成质量浓度分别为2.536，0.992，0.178，2.814，0.132，0.276，0.228，0.892 mg·mL-1的混合对照品储备液；精密量取上述混合对照品储备液2.5 mL，用甲醇定容至50 mL，制成8种成分质量浓度分别为126.8，49.6，8.9，140.7，6.6，13.8，11.4，44.6 μg·mL-1的混合对照品溶液。

2.2.2供试品溶液 取春血安胶囊20粒，倾出内容物，研细，精密称取4.0 g，加入甲醇25 mL，称定质量，超声提取30 min，放冷后用甲醇补足减失的质量，摇匀，0.45 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.2.3阴性样品溶液 按照《中国药典》2015年版一部春血安胶囊质量标准项下的处方工艺，分别制备缺肉桂、泽泻、熟地黄和盐车前子的阴性样品，再按照2.2.2项下方法制成阴性样品溶液。

2.3专属性实验 精密吸取2.2项下制备的混合对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液及空白溶剂(甲醇)各适量，按照2.1项下色谱条件进样检测，色谱图见图1。由图1可知，在与对照品相应的保留时间处，供试品色谱图中8种成分色谱峰峰形对称，与相邻杂质峰分离度均大于1.5，理论塔板数按照各成分色谱峰计算均≥4 500；图1C中未见毛蕊花糖苷和焦地黄苯乙醇苷B1色谱峰，图1D中未见肉桂酸和桂皮醛色谱峰，图1E中未见泽泻醇F、泽泻醇A、24-乙酰泽泻醇A和23-乙酰泽泻醇B色谱峰，表明阴性样品对春血安胶囊中8种成分的同时测定无干扰。

2.4线性关系 精密吸取2.2.1项下制备的混合对照品储备液0.1，0.2，0.5，1.0，1.5，2.0 mL，分别用甲醇定容至20 mL，制成系列质量浓度的混合对照品溶液，按照2.1项下色谱条件依次进样，检测8种成分的峰面积，以质量浓度为横坐标(x)、峰面积为纵坐标(y)进行线性回归，见表1。

表1 春血安胶囊中8种成分的回归方程、相关系数及线性范围

2.5精密度实验 取2.2.1项下制备的混合对照品溶液，连续进样6次，测得8种成分峰面积的RSD值分别为0.66%，0.71%，1.09%，0.57%，1.15%，0.98%，1.03%，0.84%，表明实验精密度良好。

图1 HPLC图

2.6重复性实验 取同一批春血安胶囊，按照2.2.2项下方法制备6份供试品溶液，按照2.1项下色谱条件进样测定8种成分的峰面积，计算得峰面积的RSD值分别为1.17%，1.23%，0.76%，1.02%，0.88%，1.55%，1.69%，1.47%，表明实验重复性良好。

2.7稳定性实验 取2.2.2项下制备的同一份供试品溶液(临用新配)，分别于0，2，4，6，12和18 h进样检测8种成分的峰面积，结果峰面积的RSD值分别为0.63%，0.69%，1.05%，0.59%，1.18%，1.27%，1.06，0.89%，表明供试品溶液在18 h内稳定。

2.8平均回收率 取8种成分含量已知的同一批春血安胶囊，倾出内容物，研细，精密称取2.0 g，共9份，每3份随机分为1组，置于25 mL量瓶中，依据《中国药典》2015年版四部要求，分别加入另行配制的混合对照品溶液(8种成分质量浓度分别为1.718，0.712，0.104，1.848，0.078，0.152，0.128，0.496 mg·mL-1)0.5，1.0，1.5 mL，使对照品加入量为样品含有量的50%，100%，150%，再按照2.2.2项下方法制成加样供试品溶液，按照2.1项下色谱条件进样检测8种成分的峰面积，计算各成分含量，用测得量与原有量之差除以对照品加入量计算8种成分的回收率，结果见表2。

表2 回收率实验结果

2.9含量测定 取3批春血安胶囊，按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，各批次平行3份，按照2.1项下色谱条件进样检测8种成分的峰面积并计算含量，结果见表3。

表3 8种成分的含量测定结果

3 讨论

3.1待测物的选择 春血安胶囊是由熟地黄、盐车前子、肉桂、泽泻、柴胡、山药、附片(黑附片)、三七、牡丹皮、茯苓、黄连、五味子(酒蒸)和牛膝13味中药材配伍制成的，方中熟地黄补血滋阴、益精填髓，山药生津益肺、补肾涩精，合为君药；肉桂、附片(黑附片)补火助阳、引火归元、温经止痛，三七、牡丹皮活血祛瘀、止血定痛，合为臣药；泽泻利水渗湿、泄热化浊，盐车前子清热渗湿、利尿通淋，茯苓利水渗湿，柴胡疏肝调气，黄连清热凉血，五味子(酒蒸)滋补肝肾、收敛止血，合为佐药；牛膝补肝肾、固冲任、强筋骨、壮腰膝，引诸药直达肾经，为使药。诸药配伍，相互协调、制约，共达益肾固冲、调经止血之功。依据中药质量标志物确认原则，以君药所含主要成分为首选，同时兼顾臣、佐、使药所含成分，选取君药熟地黄和佐药盐车前子所含活性成分毛蕊花糖苷和焦地黄苯乙醇苷B1，臣药肉桂所含特征成分肉桂酸和桂皮醛，佐药泽泻所含代表性成分泽泻醇F、泽泻醇A、24-乙酰泽泻醇A和23-乙酰泽泻醇B为待测物，以期全面评价春血安胶囊的质量。

3.2提取条件的筛选 春血安胶囊方中附片、三七、柴胡和黄连均是细粉直接入药，其他成分经水提加工后入药，为确保待测物提取完全，实验初期，采用加热回流提取60 min的同一条件，对提取溶剂(体积分数50%的甲醇[5-10，12，22]、甲醇[11-17，23]、体积分数为95%的乙醇)进行对比考察，结果以甲醇为提取溶剂时，8种成分综合提取率最佳，杂质干扰较小；遂对不同提取方法(超声[8-13，15-21]提取和加热回流[7，14]提取)及不同提取时间(15，30，60 min)进行对比考察，结果超声提取15 min时待测物肉桂酸和桂皮醛提取不完全，超声提取30，60 min时所得结果无明显差异，考虑到溶液制备的便捷性，最终选取甲醇超声提取30 min制备供试品溶液。

3.3流动相的选择 考虑到甲醇存在紫外末端吸收，实验中参考相关文献对乙腈-水[18-21]、乙腈-1 mL·L-1甲酸[6，22，24]、乙腈-1 mL·L-1磷酸[5，7，10-12，15-17]和乙腈-1 mL·L-1冰醋酸[8-9，13-14]流动相体系进行对比考察，结果显示，以乙腈-1 mL·L-1磷酸为流动相时基线平稳，8种成分色谱峰峰形较好，与相邻色谱峰分离效果较好，通过对流动相比例的不断优化，最终确定采用乙腈-1 mL·L-1磷酸为流动相按照2.1项下流动相比例对春血安胶囊中8种成分的含量进行同时测定。

本实验首次采用HPLC法对春血安胶囊中8种成分的含量进行了同时测定，建立了春血安胶囊多指标成分质量控制模式，该方法操作便捷、结果准确、重复性好，可为提高春血安胶囊的质量标准和综合评价提供科学依据。