一测多评法测定补心气口服液中7种成分的含量

张伯锋，王 杰，陈海燕(.济南市中医医院药剂科，济南 500；.济南市第五人民医院，济南 50000；3.广西卫生职业技术学院，南宁 53003)

补心气口服液由人参、黄芪、石菖蒲和薤白4味中药制成，主治气短、心悸、乏力和头晕等心气虚损型胸痹心痛病症[1]。现代研究表明，补心气口服液对慢性稳定型心绞痛[2]、慢性心力衰竭心气虚损证[3]、心血管神经症[4]、慢性肺心病急性发作[5]和冠心病心绞痛[6]等疾病的临床治疗效果显著，能有效改善心肌缺血和临床症状，减少心肌损伤，改善心肌供血，降低心肌耗氧和机体炎症反应，可提高患者的生活质量等。补心气口服液现行质量标准[1]和文献报道[7]仅对黄芪甲苷进行了定量检测，未对方中其他成分进行定量研究，中药及其制剂具有成分繁多复杂、协同作用的特点，单一成分控制模式难以确保中成药复方制剂临床疗效的一致性，多指标成分控制模式已广泛应用于其质量控制中。一测多评(QAMS)法利用中药成分间存在的内在函数关系，通过测定其中一种对照品稳定易得的成分，实现多指标成分含量的同时测定，降低检验成本，有助于多指标成分控制模式的普及应用。本研究参考中药质量标志物确认原则，以毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、β-细辛醚和α-细辛醚为研究对象，选取毛蕊异黄酮葡萄糖苷作为内参物，建立QAMS法同时测定补心气口服液中7种成分的含量，为全面评价补心气口服液的整体质量提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1仪器 Waters 2695型高效液相色谱仪(美国Waters公司)；Agilent 1100型高效液相色谱仪，Agilent Extend-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Zorbax Eclipse C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，美国Agilent公司；Diamonsil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，北京迪科马科技有限公司；XS105DU型电子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)。

1.2试药β-细辛醚(批号112018-201802，质量分数为99.3%)、α-细辛醚(批号100298-201203，质量分数为100.0%)、人参皂苷Rg1(批号110703-201933，质量分数为93.4%)、人参皂苷Re(批号110754-202028，质量分数为93.9%)和毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品(批号111920-201606，质量分数为97.6%)，均购于中国食品药品检定研究院；毛蕊异黄酮(批号PRF8062601，质量分数为99.6%)和芒柄花素对照品(批号PRF8091225，质量分数为99.9%)，均购于成都普瑞法科技开发有限公司；乙腈和甲醇为色谱纯，均购于天津市彪仕奇科技发展有限公司；其余试剂均为分析纯；补心气口服液(规格：10 mL·支-1；批号：190108，190509，190604)，购于湖北福人金身药业有限公司。

2 方法与结果

2.1混合对照品溶液的制备 精密称取7种成分对照品各适量，分别用甲醇制成7种成分质量浓度分别为0.162，0.318，0.746，0.372，1.294，2.956,0.978 mg·mL-1的单一对照品溶液；精密吸取上述7种单一对照品溶液各2.5 mL，用甲醇定容至50 mL量瓶中，制成各成分质量浓度分别为8.1，15.9，37.3，18.6，64.7，147.8，48.9 μg·mL-1的混合对照品溶液。

2.2供试品溶液的制备 精密吸取补心气口服液2.0 mL，用甲醇定容至25 mL，过滤，即得。

2.3阴性样品溶液的制备 按照《中国药典》2015年版一部项下补心气口服液质量标准的工艺处方，分别制备缺人参、黄芪和石菖蒲的阴性样品，再按照2.2项下方法制成阴性样品溶液。

2.4色谱条件及专属性实验 色谱柱：Agilent Extend-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流动相：乙腈(A)-1 mL·L-1磷酸(B)，梯度洗脱(0～9.0 min，16.0%A；9.0～15.0 min，16.0%A～24.0%A；15.0～28.0 min，24.0%A～52.0%A；28.0～42.0 min，52.0%A～74.0%A；42.0～50.0 min，74.0%A～16.0%A)。流速:1.0 mL·min-1；检测波长分别为203 nm(0～15.0 min检测人参皂苷Rg1和人参皂苷Re)[8-12]，257 nm(15.0～50.0 min检测毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、β-细辛醚和α-细辛醚)[13-18]；进样量：10 μL；柱温：25 ℃。精密吸取2.1项下制备的混合对照品溶液、2.2项下制备的供试品溶液和2.3项下制备的阴性样品溶液各适量，按照上述色谱条件进样检测，色谱图见图1。由图1可知，供试品色谱图中7种成分色谱峰峰形对称，理论塔板数按照各成分色谱峰计算均不低于3 000，主成分峰与相邻色谱峰分离度均大于1.5，阴性样品对补心气口服液中7种成分的同时测定无干扰。

图1 HPLC图

2.5线性关系考察 分别精密吸取2.1项下制备的7种单一对照品溶液各0.1，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL，用甲醇制成6个系列质量浓度的混合对照品溶液，按照2.4项下色谱条件进样测定7种成分的峰面积，以质量浓度为横坐标(x)、峰面积为纵坐标(y)，进行线性回归，结果见表1。

表1 各成分线性关系

2.6精密度实验 取2.1项下制备的混合对照品溶液，重复进样6次，测得7种成分峰面积的RSD值分别为1.29%，1.09%，0.96%，1.11%，0.62%，0.57%，0.79%，表明仪器精密度良好。

2.7重复性实验 取同一批补心气口服液，按照2.2项下方法平行制备6份供试品溶液，按照2.4项下色谱条件进样检测7种成分的峰面积，外标法(ESM)计算得7种成分含量的RSD值分别为1.78%，0.63%，1.39%，1.55%，1.02%，0.87%,1.14%，表明实验重复性良好。

2.8稳定性实验 取2.2项下制备的同一份供试品溶液，于制备后0，2，4，6，12，18 h进样检测7种成分的峰面积，结果7种成分峰面积的RSD值分别为1.04%，1.12%，0.93%，1.09%，0.66%，0.59%，0.82%，表明供试品溶液在18 h 内稳定性良好。

2.9回收率实验 取含量已知的补心气口服液9份，每份精密吸取1.0 mL，置于25 mL量瓶中，按照《中国药典》2015年版四部要求，分别按已知含有量的50%，100%，150% 3个水平精密加入混合对照品溶液(7种成分质量浓度分别为0.057，0.119，0.272，0.138，0.487，1.061，0.364 mg·mL-1)1.0，2.0，3.0 mL，各3份，再按照2.2项下方法制成加样供试品溶液，按照2.4项下色谱条件进样检测7种成分的峰面积，计算得7种成分的平均回收率(RSD)分别为97.44%(1.14%)，99.80%(0.75%)，100.05%(0.68%)，96.98%(0.90%)，98.87%(1.35%)，99.88%(0.73%)，97.91%(1.49%)。

2.10相对校正因子(RCFs)的计算及耐用性考察

2.10.1RCFs的计算 RCFs的计算公式：

fs/i=fs÷fi=(Xs×Yi)÷(Xi×Ys)

(1)

待测成分i质量浓度计算公式：

Xi=(Xs×Yi)÷(fs/i×Ys)

(2)

式中fs/i表示待测成分i的RCFs，X表示质量浓度，Y表示峰面积，s表示内参物，i表示其他待测成分。

精密吸取2.5项下制备的6个系列质量浓度的混合对照品溶液，进样检测7种成分的峰面积，以毛蕊异黄酮葡萄糖苷作为内参物，按照公式(1)计算其他6种成分的RCFs，结果见表2。

表2 各成分的RCFs

2.10.2不同仪器、色谱柱对RCFs的影响 精密吸取2.1项下制备的混合对照品溶液，按照2.4项下色谱条件进样检测7种成分的峰面积，考察Agilent 1100型、Waters 2695型高效液相色谱仪和Agilent Extend-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Zorbax Eclipse C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱对RCFs的影响，见表3。

表3 不同仪器、色谱柱对RCFs的影响

2.10.3不同柱温对RCFs的影响 精密吸取2.1项下制备的混合对照品溶液，按照2.4项下色谱条件进样检测7种成分的峰面积，考察不同柱温对RCFs的影响，见表4。

表4 不同柱温对RCFs的影响

2.10.4不同流速对RCFs的影响 精密吸取2.1项下制备的混合对照品溶液，按照2.4项下色谱条件进样检测7种成分的峰面积，考察不同流速(0.8，0.9，1.0，1.1，1.2 mL·min-1)对RCFs的影响，见表5。

表5 不同流速对RCFs的影响

2.11待测组分色谱峰的定位 相对保留时间值法是QAMS法中待测成分色谱峰定位的常用方法。本实验采用相对保留时间值法对待测成分色谱峰进行定位，分别记录不同仪器和色谱柱条件下7种成分的保留时间，结果见表6。

表6 不同仪器、色谱柱对相对保留时间值的影响

2.12样品含量测定 取3批补心气口服液，各批次按照2.2项下方法平行制备3份供试品溶液，按照2.4项下色谱条件进样测定7种成分的峰面积，首先采用ESM法计算7种成分的含量，再以毛蕊异黄酮葡萄糖苷作为内参物，按照2.10.1项下RCFs和公式(2)计算其他6种成分的含量，结果见表7。由表7可知，QAMS法计算值与ESM法实测值无明显差异，相对平均偏差(RAD)均<2.00%，表明RCFs可信度较高，建立的QAMS法可同时测定补心气口服液中7种成分的含量。

表7 7种成分的含量测定结果

3 讨论

3.1目标成分的选择 补心气口服液由黄芪、人参、石菖蒲和薤白4味中药材按照中医理论配伍制成，黄芪补气升阳、生津养血、行滞通痹，为方中君药；人参大补元气、生津安神，为臣药；石菖蒲化湿开胃、开窍豁痰、醒神益智，为佐药；薤白行气通阳，引药入心经，为使药。诸药共奏，以达补益心气、理气止痛的临床功效。现代研究表明，黄芪主要含有黄酮类、皂苷类、多糖类及微量元素等活性成分，其中毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素和芒柄花苷等为其黄酮类代表性成分[19]；人参的主要药效成分是人参皂苷，其中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1等为其代表性成分；石菖蒲主要含有β-细辛醚和α-细辛醚等挥发油类成分[20]。本文参考中药质量标志物优选原则，选取补心气口服液方中药物所含毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、β-细辛醚和α-细辛醚为定量测定目标成分。

3.2检测波长的确定 取2.1项下制备的7种成分的单一对照品溶液，分别在190～400 nm波长范围内进行紫外扫描，结果发现，毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素在260 nm波长附近有较大吸收，且杂质干扰较少，灵敏度较高；人参皂苷Rg1和人参皂苷Re在203 nm波长处有最大吸收；β-细辛醚和α-细辛醚在257 nm波长处有最大吸收。综合考虑7种待测成分的检测响应值和杂质干扰程度，最终确定在203 nm波长处检测人参皂苷Rg1和人参皂苷Re，在257 nm波长处检测毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、β-细辛醚和α-细辛醚。

3.3流动相的选择 本实验参考相关文献，在选择流动相时，依次对甲醇-水[14，21]、乙腈-水[8-9]、乙腈-甲醇(9∶1)[13]3个流动相系统进行考察对比，结果发现，以甲醇-水和乙腈-甲醇(9∶1)为流动相体系检测时，基线漂移严重，部分待测成分色谱峰分离不完全，可能与甲醇在低波长处有紫外吸收有关；乙腈-水流动相体系检测色谱图基线平稳，但β-细辛醚色谱峰存在拖尾现象，考虑加入酸类改善，待测成分人参皂苷Rg1和人参皂苷Re为紫外末端吸收，甲酸[14，21-22]和冰醋酸为有机酸，存在紫外末端吸收，影响色谱图基线和检测结果，而磷酸为无机酸，无紫外末端吸收，遂采用乙腈-1 mL·L-1磷酸[9]为流动相进行实验，结果7种成分色谱峰峰形对称，与相邻色谱峰的分离度均大于1.5，色谱图基线较为平稳。同时对流动相比例不断优化，最终按照2.4项下的流动相洗脱程序对补心气口服液中7种成分的含量进行同时测定。

4 结论

本实验首次采用QAMS法对补心气口服液中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、β-细辛醚和α-细辛醚的含量进行同时测定，所建立的方法操作简单、结果准确，对补心气口服液的质量标准提升和全面评价提供了参考。