脑梗死大鼠外周血中CD4+CD25+调节性T细胞表达对神经功能变化的影响

张双 邓华江 张丽云 邓家琦 葛红飞 梁雪梅

(西南医科大学附属医院 1老年病科，四川 泸州 646000；2神经外科；3健康管理中心；4超声科；5陆军军医大学西南医院神经外科)

神经功能缺损不仅是脑梗死患者的常见症状，也是造成罹患脑梗死群体致残率与病死率高的主要原因，因此早期预测与干预对改善神经细胞功能、改善神经功能缺损尤为重要〔1，2〕。动脉粥样硬化是造成个体罹患脑梗死的重要原因，而免疫反应与炎症反应在动脉硬化斑块形成过程中的作用不容小觑〔3〕。调节性T细胞属于成熟T淋巴细胞亚群，是脑梗死后脑损伤的重要保护调节器，在免疫性疾病发生、确保机体免疫耐受能力方面意义重大，CD4+CD25+调节性T细胞(CD4+CD25+Treg)属于免疫调控细胞，是目前免疫机制相关指标的研究热点〔4〕。相关研究显示，调节性T细胞对抗脑梗死免疫损伤过程中具有重要意义〔5〕。本研究拟分析脑梗死大鼠建模成功后不同时期CD4+CD25+Treg及神经功能情况及其相关性。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择清洁级雄性大鼠60只，周龄5～8 w，平均(6.72±0.76)w；体重0.20～0.28 kg，平均(0.24±0.02)kg。试剂制备：①4.0%多聚甲醛溶液：13.6 g磷酸二氢钾+3.2 g氢氧化钠+40 g多聚甲醛混匀，加水至1 000 ml，并将pH值调至7.2～7.4，并过滤上述溶液待用。②柠檬酸缓冲液：0.4 g柠檬酸+3.0 g柠檬酸三钠混匀，加水至1 000 ml，并将pH值调至6.0，并过滤上述溶液待用。③磷酸盐缓冲液：0.2 g氯化钾+8.0 g氯化钠+0.4g磷酸氢钾混匀，加水至1 000 ml，并将pH值调至7.35～7.45，并过滤上述溶液待用。线栓制备与处理：1.2号棕色的单尼龙鱼线，直径0.181 mm，将其修剪为22 mm长，30根备用，鱼线两端用烧灼发将其制备成圆钝形，头端直径0.22～0.24 mm，75%酒精浸泡24 h用生理盐水灭菌备用。

1.2仪器与设备 高速离心机：Thermo公司，BACTEC 9128全自动培养仪：美国R&D公司，Leica切片机：德国Leica公司，甲醛：湖南化工厂，Tap酶：大连宝生物工程有限公司；大鼠转化生长因子(TGF)-β1酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(96T)：美国R&D公司，货号891126。CD4-FITC、CD25-Percp、IgG2ak-PE、IgGlk-Percp、Foxp3-PE：美国eBoiscience公司，破膜液：博士德生物技术有限公司，流式细胞仪：美国贝克曼库尔特公司。

1.3建立大鼠模型与分组 (1)分组：60只雄性大鼠适应性饲养1 w后，选择30只作为假手术组，另30只建立大脑中动脉闭塞(MCAO)模型。(2)建立MCAO模型：依据Zea-Longa线栓法〔6〕建立MCAO模型，具体方法：大鼠禁食水12 h，350 mg/kg 10%水合氯醛(腹腔注射)，直至大鼠对疼痛刺激无反应，并将大鼠背部固定在手术板上，局部消毒、备皮，切口：颈部正中稍偏左，2.0～2.5 cm，分离双侧甲状腺，暴露左侧三角区(胸锁乳突肌与胸骨舌骨肌之间)，将左侧颈总与颈外动脉钝性分离，并结扎颈外动脉，小动脉夹闭颈总动脉分叉与近心端，用一次性针头在近心端处扎一小孔，用预先处理好的鱼线从颈外动脉处插入，利用鱼线与8-0单尼龙丝线结扎入孔处，结扎松紧适宜，松开动脉夹，利用微动脉夹夹住翼腭动脉，并向颈内动脉缓慢送入18～20 mm阻力感明显时停止并松开微小动脉夹，将线尾端减掉，清洗并逐层缝合组织与皮肤。术毕帮助大鼠侧卧位，保暖，并保持呼吸道通畅。(3)制模成功：术毕清醒后，根据Zausinger六分法〔7〕评估大鼠神经功能：0分：无法自发行走；1分：自由行走时向健侧旋转；2分：抓住尾巴，大鼠向健侧旋转；3分：向大鼠病灶对侧施加压力，大鼠抵抗力明显下降；4分：大鼠健侧前爪无法伸直；5分：无神经功能缺损症状。Zausinger评分为1～4分为建模成功，5分为建模失败，本研究中建模大鼠评分均为0～4分，均建模成功。分别于建模成功后12、24、72 h后处死大鼠，每次10只，所有大鼠给予人性化处死，本研究中全部大鼠的处理均依据《关于善待实验动物指导性意见》〔8〕中意见。

1.4指标监测与方法 大鼠麻醉后心脏取血，向检测管与对照管中逐次加入CD4-FITC 1 μl、CD25-Percp和IgGlk-Percp 0.5 μl，加入0.5 ml破膜液后在4℃冰箱中孵育45 min，再次加入2 ml破膜液，加入IgG2ak-PE与Foxp3-PE洗涤1次，再次加入1%多聚甲醛重悬0.5 ml，观察CD4+CD25+Treg情况。所有操作由专业人员在严格指导下完成。

1.5统计学方法 采用SPSS23.0软件进行t检验、双变量Pearson直线相关性检验。

2 结 果

2.1脑梗死大鼠建模成功12、24、72 h CD4+CD25+Treg与神经功能情况 与假手术组相比，模型组建模成功12、24、72 h后神经功能得分显著降低(P<0.05)；24、72 h CD4+CD25+Treg显著降低(P<0.001)。见表1。

表1 脑梗死大鼠建模成功12、24、72 h CD4+CD25+Treg与神经功能情况比较

2.2脑梗死大鼠CD4+CD25+Treg与神经功能变化的相关性 脑梗死大鼠CD4+CD25+Treg与神经功能(Zausinger评分)呈正相关(r=0.593，P=0.001)，见图1。

图1 脑梗死大鼠CD4+CD25+Treg表达与神经功能相关性

3 讨 论

免疫反应在动脉硬化斑块的形成与进展中具有重大意义，而动脉粥样硬化又是导致个体罹患脑梗死的重要病理基础，伴随脑梗死病理机制的不断深入研究，免疫机制有望成为治疗脑梗死疾病的重要切入点〔9〕。线栓法建立脑梗死大鼠模型，是利用线栓阻断动脉血管的血液循环，可真实反映脑梗死的发病进展，在脑梗死动物实验模型中应用广泛〔10〕。

CD4+CD25+Treg属于免疫调控细胞，主要通过释放白细胞介素细胞10、TGF-β来达到调控T细胞与细胞因子平衡的目的〔11〕。个体罹患急性脑梗死疾病后，机体内大量炎症物质造成自身免疫系统紊乱，免疫T细胞活性被削弱，导致机体免疫耐受力下降，氧自由基水平不断增加，线粒体细胞被不断杀灭，血管内皮功能遭受损害并不断加重，机体过氧化反应不断加重，直接造成CD4+CD25+Treg水平不断降低，而CD4+CD25+Treg不断下降又反作用于疾病本身，导致脑梗死病情不断加重，如此形成负性循环；再者，CD4+T细胞不断分化Th1细胞，血清中Th1细胞表达水平不断升高，机体出现免疫过表达状态，限制了CD4+CD25+Treg生成，继而促进炎症因子参与动脉斑块形成、性质改变及神经功能损害过程〔12～14〕。本研究结果表明，CD4+CD25+Treg在脑梗死疾病进展中具有重要意义，提示CD4+CD25+Treg在控制疾病进展过程的重要性。脑梗死由于梗死病灶阻断神经组织供血，导致阻断的神经出现损伤，若在有限的时间窗内梗死的病灶无法顺利再通，将直接造成神经损害程度不断加重，机体极易产生永久性神经功能损害〔15，16〕。本研究结果表明神经功能损伤伴随着脑梗死的进展过程。鉴于上述原因，考虑脑梗死大鼠神经功能缺损是否与CD4+CD25+Treg存在某种联系。

为进一步探究脑梗死大鼠CD4+CD25+Treg与神经功能变化之间的关系，本研究结果显示，随着大鼠CD4+CD25+Treg不断降低，脑梗死大鼠神经功能不断下降。分析其原因可能为：脑梗死发生后，因疾病原因造成局部组织缺血缺氧性损害，大量炎症细胞因此分泌并浸润至组织中，炎症细胞分泌诸多炎症因子，导致神经功能损害不断加重〔17，18〕。由此可考虑将CD4+CD25+Treg动态表达情况作为预测脑梗死个体神经功能情况的指标，但其预测机制在本研究中并未体现，仍需要未来进一步分析研究。

综上，脑梗死大鼠梗死早期CD4+CD25+Treg未见明显改变，随着梗死时间延长，大鼠CD4+CD25+Treg逐渐降低，神经功能损伤程度加重，二者间存在相关性，考虑早期通过检测脑梗死CD4+CD25+Treg对预测神经功能、指导治疗有积极意义。