miR-24对氧化低密度脂蛋白胆固醇诱导的人脐静脉内皮细胞自噬的影响

杨鹏 罗雪兰 颜渊鸳 李丹 赵燕姣 杨瑞霞 欧和生

(1广西国际壮医医院，广西 南宁 530001；2广西医科大学药学院)

动脉粥样硬化(AS)是一种血管管壁内膜的慢性炎性病变，其发生发展受多种因素的影响，其中，血管内皮细胞(VEC)损伤是AS发生发展的始动环节〔1〕。自噬是细胞在生长、分化与发育过程中实现代谢需求的关键过程，该过程主要通过细胞将受损细胞器与变性蛋白运输至溶酶体进行消化降解〔2，3〕。资料表明，VEC自噬广泛存在AS的过程中，自噬不足或自噬过度可诱导内皮细胞凋亡，从而启动并加速AS的形成〔4〕。

微小RNA(miRNA)是一类非编码的单链小RNA，它通过特异性识别靶基因mRNA的3′非转录区，介导靶基因mRNA的降解或翻译抑制，从而下调靶基因的表达，并参与细胞增殖、分化、凋亡、自噬和AS病理生理等多种生物学过程〔5～7〕。miR-24属于miR-23～27～24 家族，有研究显示在家族性高胆固醇血症的病人体内，miR-24的表达量显著增加〔8〕，提示miR-24与AS的联系密切，但具体机制尚未明了。VEC自噬对AS具有重要的病理治疗意义。生理状态下VEC通过活化自噬促进溶酶体降解氧化低密度脂蛋白胆固醇(ox-LDL)抵御其诱导的损伤，当ox-LDL蓄积超过细胞代谢能力时，VEC受损诱发AS，此时通过增加VEC自噬的途径可降低AS 的发生〔9〕。新近研究证明，某些miRNAs对VEC自噬具有明显的调控作用，而miR-24与VEC自噬活性之间的关系则鲜有报道。ox-LDL是一种有效的AS促进因子，目前被广泛用于诱导血管炎症、损伤及AS的发生发展。本研究通过ox-LDL诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)自噬，探讨miR-24对HUVECs自噬的调控作用及ox-LDL对HUVECs中miR-24表达的影响，进一步探讨miR-24通过调控自噬在AS中发挥的作用。

1 材料与方法

1.1细胞株、仪器及试剂 HUVECs购自武汉Procell公司。透射电子显微镜(日本HITACHI公司)；超净工作台(新加坡艺思高科技有限公司)；低速离心机(上海菲恰尔分析仪器有限公司)；倒置显微镜(日本Olympus公司)；CO2饱和湿度培养箱(美国Thermo Forma公司)；酶联免疫检测仪Model-450(美国Thermo Forma公司)；实时荧光定量(qRT)-聚合酶链反应(PCR)仪(原应用生物系统公司)；小型高速冷冻离心机(赛默飞·世尔科技有限公司)；蛋白电泳仪、蛋白质转膜仪(美国Bio-Rad公司)；Odyssey荧光扫描成像系统(美国LI-COR CXL)。DMEM培养基(Gibco公司)；胎牛血清(Lonsera公司)；0.25%胰蛋白酶消化液(Gibco公司)；ox-LDL(广州奕源生物科技有限公司)；四甲基偶氮唑盐(MTT，Solarbio公司)；RNA提取试剂盒(Axygen生物公司)；逆转录试剂盒及SYBR荧光定量PCR试剂盒(均购自日本TAKERA公司)；慢病毒载体(上海吉凯基化学技术有限公司)；LC3-Ⅰ/Ⅱ、Beclin-1和P62抗体(均购自Cell Signaling Technology)；内参GAPDH抗体(Proteintech)，抗兔IgG(H+L)荧光二抗(Cell Signaling Technology)。

1.2方法

1.2.1miR-24慢病毒载体的构建与鉴定 以miR-24序列(来自http://www.miRbase.org)：5′UGGCUCAGUUCAGCAGGAACAG-3′为根据，设计miR-24的发夹结构，应用PCR技术获取目的基因片段，通过基因重组技术(AgeI/NheI 酶切)将目的基因克隆到GV367载体的MCS中(载体元件顺序：Ubi-MCS-SV40-EGFP-IRES-puromycin)，接着进行PCR鉴定及DNA测序比对分析确定载体形成miR-24高表达慢病毒颗粒即LV-GV367-miR-24，同体构建成功后用慢病毒包装相应的GV367载体时根据miR-24反义序列及随机对照序列构建LV-GV367-anti-miR-24和LV-GV367-阴性对照NC。GV367载体上含有增强绿色荧光蛋白(EGFP)标记及嘌呤霉素抗性，故已转染细胞可见绿色荧光，且可用嘌呤霉素进行筛选，建立稳定表达目的基因的细胞株。

主要以陕西省榆林市清涧地区作为试验所在地。该地区是典型的黄土高原丘陵沟壑区，昼夜温差大，年均气温10摄氏度，年均降水450毫米，无霜期200天。

1.2.3细胞的分组及ox-LDL诱导HUVECs自噬 将实验细胞随机分为5组：正常组、ox-LDL组、阴性对照组、anti-miR-24组、miR-24组。正常组不给予任何干预，ox-LDL组用终浓度为100 μg/ml的ox-LDL工作液干预6 h诱导细胞自噬〔10〕。阴性对照组、anti-miR-24组、miR-24组的细胞先分别感染相应的慢病毒载体，然后用终浓度为100 μg/ml的ox-LDL工作液干预6 h诱导细胞自噬。

外卖是大多数年青上班族的午餐首选，因为午休时间短，又懒得下楼买，只得叫外卖。可是现在外卖的质量情况堪忧，如何才能健康吃外卖呢？

1.2.4qRT-PCR法检测miR-24、LC3-Ⅱ、Beclin-1和P62 mRNA的表达 按RNA提取试剂盒提取各组细胞的总RNA，并测定浓度。予上海生工生物工程提供引物设计(序列见表1)，严格按照RNA逆转录试剂盒与荧光定量PCR试剂盒说明进行逆转录和qRT-PCR。miR-24反应条件：95 ℃ 1 min变性，95℃ 15 s、60℃ 30 s，40个循环，以U6作为内参。目的基因反应条件：UDG酶激活2 min；95℃，2 min；95℃，15 s；60℃，15 s；72℃，1 min；第2～4步进行40个循环，以GAPDH作为内参。每个样本重复测定3次，取平均值，采用2-ΔΔCt法计算mRNA的相对表达量。

表1 引物序列

1.2.7Western印迹法检测LC3-Ⅰ/Ⅱ、Beclin-1、P62的蛋白表达量 实验组细胞给予ox-LDL诱导自噬后，收集培养液及培养瓶内的细胞，将各组细胞裂解，12 000 r/min、4℃离心15 min，取上清液。应用二喹啉甲酸(BCA)标准曲线蛋白定量，分别取各组的蛋白30 μg进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)并转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。用脱脂奶粉封闭1 h后加入Ⅰ 抗(稀释比例1∶1 000)湿盒孵育过夜(4℃)。第2 天用TBST冲洗3次，每次10 min，然后加入 Ⅱ 抗(H+L荧光标记)(稀释比例1∶10 000)孵育1 h，重复用TBST冲洗3次，每次10 min。利用双色荧光扫描成像系统分析蛋白电泳条带的灰度值，计算蛋白的表达量，以GAPDH为内参，蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值。实验重复3次，取平均值。

2.3透射电镜观察各组细胞超微结构 透射电镜观察结果显示(图1)，正常组细胞的细胞质内各细胞器分布基本正常，细胞核形态正常，细胞质中偶见少量自噬小体；ox-LDL组细胞质中可见数个散在于细胞质中的双层膜结构的自噬小体及内含细胞器的空泡状自噬溶酶体，数量与阴性对照组相当。miR-24组细胞中的自噬小体较ox-LDL组少，细胞核形态基本正常，anti-miR-24组细胞中可见较多自噬小体。结果提示，在诱导细胞发生自噬后，过表达miR-24可抑制细胞自噬的程度。

2.1慢病毒转染前后细胞miR-24的表达量 正常组miR-24相对表达量(1.00±0.00)与阴性对照组(1.10±0.01)比较，差异无统计学意义(P>0.05)，miR-24组miR-24相对表达量(1.82±0.12)明显高于正常组和阴性对照组，anti-miR-24组miR-24相对表达量(0.47±0.10)明显低于正常组和阴性对照组，差异均有统计学意义(均P<0.05)。说明miR-24组、anti-miR-24组慢病毒成功转染HUVECs并影响细胞miR-24表达，而阴性对照组慢病毒转染不影响细胞miR-24表达，稳转细胞株构建成功。

1.2.5透射电镜观察细胞内超微结构自噬小体 分别消化收集各实验组细胞，0.1 mol/L磷酸缓冲液漂洗1次，低温离心(1 000 r/min，5 min，4℃)，弃上清液，沿管壁加入提前预冷的2.5%戊二醛电镜级固定液1 ml，置于4℃冰箱避光固定过夜。0.1 mol/L磷酸缓冲液漂洗3次,每次15 min，1.0%锇酸溶液后固定2 h(4℃)。0.1 mol/L磷酸缓冲液漂洗3次,每次15 min，50%、70%、90%、3次100%梯度丙酮逐级脱水，每次15 min。100%丙酮∶树脂=1∶1渗透2 h，100%丙酮∶树脂=1∶2渗透2 h，纯树脂渗透过夜，环氧树脂618包埋，烘箱聚合(37℃ 15 h，45℃ 12 h，60℃ 24 h)。超薄切片，厚度60～70 nm，醋酸铀、柠檬酸铅双染色，上机观察。

把容易的问题安排给后进生答，这样可以激发后进生的学习积极性，启发和培养他们的思维能力。而对于成绩比较优秀的学生，教师要给他们提供一些稍微有些难度的问题，让他们通过努力思考可以得出答案。同时，老师在提出问题后，还要相机点拨，为学生的思考“架桥”，降低问题的坡度，以利于学生逐步接近“目标”，达到预期的教学效果。从学生的实际出发，面向全体，让每个学生都成为课堂的主人、学习的主体，使得班内各层次的学生都得到发展。

1.3统计学方法 采用SPSS25.0软件进行单因素方差分析、SNK-q检验。

继续优化移民户收入结构，加速农村劳动力转移步伐，由出台的劳务经济补偿机制带动大量劳务经济兴起，不断带动劳务输出，通过政策引导鼓励农民外出务工，不断利用扶贫培训政策，大力提高农村劳动力素质和专业技能，大力完善劳务派遣制度。

2 结 果

大食与唐朝交往密切。唐开元四年（716）“七月,大食国黑密牟尼苏利漫遣使上表,献金线织袍、宝装玉洒池瓶各一”。大食国黑密牟尼苏利漫即白衣大食第十代哈里发苏莱漫（sulaiman，715-717）,而“金线织袍”实物在都兰大墓所出织金锦似乎得到了证实。

2.2ox-LDL对HUVECs中miR-24表达量的影响 用100 μg/ml ox-LDL 干预HUVECs 6 h后，用qRT-PCR法检测正常组和ox-LDL组的miR-24相对表达量。结果显示，ox-LDL组miR-24表达水平(0.35±0.10)均明显低于正常组(1.00±0.00)，差异有统计学意义，提示ox-LDL可明显下调HUVECs中miR-24表达水平。

受纳入研究样本量较少的限制，本文研究方法可能存在一定的局限性，有必要行大样本的随机对照研究以进一步证实。综上所述，对于脑卒中患者采用中医延续护理能够显著改善患者的临床症状，提高患者的生活质量与耐受性，值得临床实践中应用与推广。

1.2.6MTT法检测细胞活性 细胞分别以每孔8×103个接种到96 孔板，待细胞贴壁后加入终浓度100 μg/ml ox-LDL药物干预6 h。弃去培养基，每孔加入100 μl新配制MTT(工作液浓度0.5 mg/L)，37℃孵育4 h，小心弃去孔中培养液，每孔加入DMSO 150 μl，震荡10 s，酶标仪490 nm 波长测定吸光度值(A490 nm)。实验重复3次，取平均值。

图1 各组细胞超微结构及自噬小体观察结果比较(×25 000)

2.4各组HUVECs细胞活性比较 miR-24组OD值(0.35±0.08)、anti-miR-24组OD值(0.68±0.12)、阴性对照组(0.72±0.10)、ox-LDL组(0.71±0.09)均明显低于正常组(0.89±0.04)，miR-24组OD值明显低于阴性对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，阴性对照组与ox-LDL组、anti-miR-24组比较，差异均有统计学意义(均P>0.05)。提示表达miR-24能在一定程度上抑制HUVECs的活性。

1.2.2HUVECs转染 HUVECs用含20%新生胎牛血清的DMEM培养液，加入双抗：青霉素100 IU/ml和链霉素0.1 mg/ml，在37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养，取生长状态良好的细胞以每孔5×105个细胞接种到6孔板，培养24 h。3种慢病毒以感染指数MOI=70感染HUVECs，置于培养箱孵育48 h，在倒置荧光显微镜下观察荧光表达情况，加入嘌呤霉素(10 μg/ml)进行筛选。

2.5各组细胞LC3-Ⅰ/Ⅱ、Beclin-1及P62蛋白相对表达量比较 Western印迹结果显示(图2)，阴性对照组、anti-miR-24组ox-LDL组LC3-Ⅰ/Ⅱ与Beclin-1表达明显高于正常组，而ox-LDL组、阴性对照组、anti-miR-24组及miR-24组的P62的表达明显低于正常组，差异均有统计学意义(均P<0.05)，说明ox-LDL能显著诱导细胞发生自噬。anti-miR-24 组LC3-Ⅰ/Ⅱ与Beclin-1表达量明显高于阴性对照组，P62的表达量明显低于阴性对照组，差异均有统计学意义(均P<0.05)。而miR-24组的LC3-Ⅰ/Ⅱ与Beclin-1表达量明显低于阴性对照组，P62的表达量明显高于阴性对照组，差异均有统计学意义(均P<0.05)。提示在ox-LDL诱导细胞自噬后，过表达miR-24能抑制HUVECs自噬水平。见表2。

1～5：正常组、ox-LDL组、阴性对照组、anti-miR-24组、miR-24组

表2 各组细胞LC3-Ⅰ/Ⅱ、Beclin-1及P62蛋白的相对表达量

2.6各组细胞LC3-Ⅱ、Beclin-1及P62 mRNA相对表达量比较 阴性对照组、anti-miR-24组、miR-24组、ox-LDL组的LC3-Ⅱ与Beclin-1 mRNA相对表达量均明显高于正常组，而P62 mRNA相对表达量均明显低于正常组，差异均有统计学意义(均P<0.05)。anti-miR-24 组的LC3-Ⅱ与Beclin-1 mRNA相对表达量明显高于阴性对照组，而P62 mRNA相对表达量明显低于阴性对照组，差异均有统计学意义(均P<0.05)。miR-24 组的LC3-Ⅱ与Beclin-1 mRNA相对表达量明显低于阴性对照组，，而P62 mRNA相对表达量明显高于阴性对照组，差异有统计学意义(均P<0.05)。提示miR-24过表达可在转录水平进一步下调LC3-Ⅱ与Beclin-1的表达量及上调P62的表达量。见表3。

表3 各组细胞LC3-Ⅱ、Beclin-1及P62 mRNA相对表达量

3 讨 论

本研究发现ox-LDL能诱导HUVECs产生自噬，同时还能下调HUVECs中miR-24的表达。进一步研究发现，miR-24对ox-LDL诱导的HUVECs自噬具有明显的抑制作用，再一次验证了miR-24显著抑制HUVECs的增殖能力。因此推测过表达miR-24可通过抑制ox-LDL诱导的HUVECs自噬并抑制细胞增殖，进而发挥其在AS中的作用。

VEC在血管结构的维持与功能方面发挥着重要的作用，VEC损伤和自噬异常对AS的发生和发展有促进作用〔11〕。血管内皮受到有害刺激后会诱发自噬以保护细胞免受损伤。但是自噬异常也会导致内皮细胞的凋亡，导致内皮完整性丧失，局部脂质沉积，AS和斑块不稳定〔12〕。自噬过程由一系列自噬相关基因(Atg)介导完成，其中以酵母自噬基因Atg6同源物Beclin-1和LC3为代表性蛋白〔13〕。自噬发生时，细胞溶质形式的LC3(LC3-Ⅰ)与磷脂酰乙醇胺(PE)缀合形成LC3-PE缀合物(LC3-Ⅱ)，被募集到自噬体膜中〔14〕。LC3-Ⅱ始终稳定地保留在自噬体膜上直到与溶酶体融合，因此可作为自噬体的标记蛋白〔15〕。另外，Beclin-1也可以调节自噬体的形成，而且能促进其成长成熟，亦是调控细胞自噬的必要因子〔16〕。P62是多功能的泛素化结合蛋白，它通过与LC3直接绑定，部分性地进入自噬体内，并在自噬期间被不断分解，因此其表达程度与自噬程度具有相反性。ox-LDL作为一种刺激因素可诱导内皮细胞产生自噬，Zhang等〔17〕研究发现，ox-LDL能上调内皮细胞中自噬相关基因Beclin-1和LC3Ⅱ的表达，且分别在0.5 h和6 h时自噬蛋白的表达达到峰值。本研究结果提示，通过ox-LDL刺激可诱发HUVECs产生自噬。

miRNA是人体内的一种对基因具有调控作用的重要小分子核糖核酸，参与多种疾病的病生理过程〔18〕。当机体受到某种刺激以后，组织或细胞内的miRNA水平就会出现不同程度的上调或下调，从而发挥对机体的保护或者损害作用。有研究表明，ox-LDL可诱导细胞中的miRNA水平发生改变。Tang等〔19〕研究发现，ox-LDL以时间和剂量依赖性方式下调HUVECs中miR-21 的水平，过表达 miR-21 可增强ox-LDL诱导的HUVECs自噬，抑制AS。Chen等〔20〕报道miR-155的过表达可诱导肿瘤细胞自噬的激活，进而促进肿瘤细胞存活和化学抗性。本研究结果提示ox-LDL能下调HUVECs中miR-24的表达水平。

大多数miRNA具有抑制自噬的作用，但也有少部分miRNA具有促进自噬作用。miR-216a 通过下调Beclin1和 ATG5抑制ox-LDL诱导的自噬〔21〕。miR-214-3p可通过直接靶向ATG5的3′-UTR抑制HEK293 细胞自噬〔22〕。研究发现，miR-155可通过增强LC3和降低p62 mRNA水平增强ox-LDL诱导的HUVECs自噬。尽管目前已证实多种miRNA对细胞自噬具有调控作用，但关于miR-24与自噬的研究则鲜有报道。本研究结果提示miR-24对ox-LDL诱导的HUVECs自噬具有一定的调节作用。

VEC自噬在AS发生发展中具有重要作用，miR-24可通过调节VEC自噬的作用进而发挥其在AS中的作用。但是，本研究仅是miR-24体外实验的初探，并且机制研究深度不够，要进一步验证这一机制，还需要开展下一步的体内实验进行验证。