HOXB9基因与脑胶质瘤替莫唑胺化疗耐药的相关性

余直臻 喻喆 方立萍

(大连医科大学附属第二医院，辽宁 大连 116023)

脑胶质瘤生长迅速，侵袭性、浸润性强，正常脑组织与肿瘤组织之间界限模糊，外科治疗彻底清除病灶组织难度系数大，且因诸多药物难以进入血脑屏障，化疗药物长时间使用后会出现耐药性等因素影响，即使是为患者采用外科手术联合放化疗辅助方案，治疗效果也不理想，因此开发高效的治疗靶点来提高脑胶质瘤的整体化疗获益亟不可待〔1〕。替莫唑胺属于脑胶质瘤治疗一线药物，但患者易对其产生耐药，影响治疗效果，既往研究指出，替莫唑胺的耐药性与多耐药蛋白密切相关〔2〕。而多重耐药主要表现为多重耐药相关分子的表达异常，如P糖蛋白(P-gP)、O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)、DNA错配修复(MMR)系统等〔3〕。人类mut-s同系物(hMLH)、hMSH2是参与错配修复功能的重要基因，hMLH、hMSH2基因的稳定性将直接影响细胞的错配修复功能，而HOXB9隶属于HOX基因家族，在诸多恶病质如乳腺癌、肺癌等中表达异常，在促进肿瘤病灶生长、侵袭、凋亡等过程中举足轻重〔4〕。由此考虑脑胶质瘤患者在替莫唑胺化疗过程中，HOXB9基因表达是否异常，基因的表达情况是否与替莫唑胺化疗耐药存在某种关联。本研究旨在通过观察脑胶质瘤化疗患者HOXB9基因与多药耐药相关分子表达情况其上述指标之间的关系。

1 资料与方法

1.1研究对象 本研究方法与思路的设计均严格遵照医学伦理委员相关规定，且均在取得患者和(或)监护人同意后整理临床资料。回顾性分析2018年1月至2020年4月大连医科大学附属第二医院完成化疗且符合条件的脑胶质瘤患者的临床资料，纳入标准：①均经磁共振成像技术确诊为脑胶质瘤；②外科术后均接受替莫唑胺化疗；③患者病理组织封存完好；④临床治疗保存完善。排除标准：①已经出现远处继发性转移；②合并其他部位恶病质者；③身体素质低下，难以耐受化疗者；④心脏、肾等重要脏器失功。最终纳入82例脑胶质瘤患者，其中男42例，女40例；年龄60～78岁，平均(69.52±2.19)岁；肿瘤类型：星形细胞瘤35例，胶质母细胞瘤24例，少枝胶质细胞瘤15例，其他8例。脑胶质瘤患者替莫唑胺耐药性情况分为耐药组34例，非耐药组48例。耐药组男17例，女17例；年龄60～77岁，平均(69.23±2.15)岁；肿瘤类型：星形细胞瘤14例，胶质母细胞瘤10例，少枝胶质细胞瘤8例，其他2例。非耐药组男25例，女23例；年龄60～78岁，平均(69.61±2.21)岁；肿瘤类型：星形细胞瘤21例，胶质母细胞瘤14例，少枝胶质细胞瘤7例，其他6例。两组基线资料差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2替莫唑胺化疗耐药判定 替莫唑胺化疗患者药物敏感性分析参照文献〔5〕中方法进行判定。

1.3仪器与试剂 人恶性脑胶质瘤株U251由中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所提供；胎牛血清、DMEM由美国Solarbio公司生产，噻唑蓝(MTT)试剂盒选自碧云天生物技术有限公司，Tranawall小室由美国Corning公司生产，兔抗人HOXB9及兔抗人IgG二抗均选自美国Abcam公司，引物的设计合成由上海吉玛制药技术有限公司完成，cDNA逆转录的PrimeScript逆转录试剂盒由北京康为世纪生物科技有限公司提供，荧光定量PCR试剂盒选择SYBR Premix ExTaqTMⅡ，均由北京康为世纪生物科技有限公司提供，兔抗人MGMT、hMSH2、hMLH多克隆抗体均选自武汉博士德公司，EnVisionTM兔/鼠型染色试剂盒由上海基因公司提供。

1.4标本处理 所有标本常规固定、脱水、切片、石蜡包埋、苏木素染色。上述所有操作严格遵照试剂、仪器、试剂盒说明书进行，且整个操作过程均由专业人员在严格质控下完成。

1.5HOXB9基因〔6〕参照文献〔7〕中判定方法：选取5个高倍视野(细胞计数>200)观察阳性细胞染色强度并计算阳性细胞占比，判定细则为：染色阳性信号为细胞核出现棕黄色颗粒，0分无染色，1分浅黄色，2分黄色，3分棕黄色；再按照阳性细胞占比计分：0分为阳性细胞占比<5%，1分为≥5%且<25%，2分为≥25%且<50%，3分为≥50%且<75%，4分为≥75%，两者相乘为最终积分，并根据最终得分作为染色程度进行统计学计算。

1.6P-gP与MGMT结果判定 参照文献〔7〕中相关判定方法，阳性：脑胶质瘤细胞膜或胞质内可见棕黄色颗粒且占比10%～30%，强阳性：阳性细胞数占比≥30%；阴性：阳性细胞数占比<10%。

1.7hMLH与hMSH2 参照文献〔8〕中相关判定方法 随机选择切片中10个高倍视野内400个脑胶质瘤细胞中阳性细胞占比，阳性：脑胶质瘤细胞内可见棕黄色的颗粒，且阳性细胞占比≥25%，阴性：阳性细胞占比<25%。

上述判定结果均将武汉博士德公司提供的阳性切片作为阳性对照，5%胎牛血清替代一抗视为阴性对照，且本次研究将阳性、强阳性均视为阳性。

1.8统计学方法 采用SPSS23.0软件进行χ2检验、Spearman分析及Logistic回归分析。

2 结 果

2.1HOXB9基因与多药耐药相关分子表达 与非耐药组相比，耐药组HOXB9、P-gP、MGMT阳性率较高，hMLH、hMSH2阴性率较高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 两组HOXB9基因与多药耐药相关分子表达对比〔n(%)〕

2.2HOXB9基因与多药耐药因子相关性分析 HOXB9基因与P-gP、MGMT表达呈正相关(r=0.815、0.876，均P<0.001)，HOXB9基因与hMLH、hMSH2呈负相关(r=-0.213、-0.254，均P<0.05)。

2.3HOXB9基因对脑胶质瘤患者采取替莫唑胺化疗时耐药的回归分析 将脑胶质瘤患者采取替莫唑胺化疗时耐药情况作为因变量，HOXB9基因作为自变量，经Logistic回归分析证实，HOXB9基因阳性表达可能是脑胶质瘤患者替莫唑胺化疗耐药的影响因素(OR>1，P<0.001)。见表2。

表2 HOXB9基因对脑胶质瘤患者替莫唑胺化疗耐药的回归分析

3 讨 论

脑胶质瘤耐药机制繁冗复杂，尽管临床关于恶病质耐药基因及其产物的研究诸多，但有关人脑胶质瘤患者采取替莫唑胺化疗时耐药基因与脑胶质瘤耐药性的关系尚未明确。探究耐药基因与脑胶质瘤患者耐药性之间的关系，对降低脑胶质瘤患者对替莫唑胺的耐药性，提高临床化疗效果尤为重要。

研究显示，脑胶质瘤患者化疗产生耐药性是由多种因素相互作用的结果，总结分析造成脑胶质瘤患者对化疗产生耐药性的原因可能有：①化疗药物难以透过血脑屏障；②蓄积在脑胶质瘤细胞中的药物较少；③诸多化疗药物解毒、代谢进程加快；④DNA损伤修复影响等〔9〕。近期，随着临床对脑胶质瘤化疗耐药性的研究不断深入，初步得出HOXB9基因、多耐药相关分子的表达产物P-gP、MGMT、hMLH、hMSH2等与脑胶质瘤患者化疗耐药性密不可分〔10〕。替莫唑胺富含咪唑四嗪环，属于临床脑胶质瘤一线化疗药物，容易透过血脑屏障，致使脑胶质瘤细胞DNA烷基化，进而发挥细胞毒性作用〔11〕。替莫唑胺虽一定程度上改善了患者预后，但有效率较低，尤其是对复发性脑胶质瘤患者的有效性更低，造成这一现象的主要原因主要与脑胶质瘤患者对替莫唑胺的耐药性增加有关〔12〕。由此可见，探寻逆转耐药的高效途径，对提高脑胶质瘤患者的化疗效果尤为关键。

HOXB9基因隶属于Hox转录因子家族，研究表明，Hox家族成员不仅参与胚胎发育、干细胞自我修复更新、组织重建等生理过程，与诸多恶病质发生、进展也密不可分，此外还能够编码转录因子，调节基因彼此之间的协同表达〔13〕。刘琪等〔14〕研究发现，HOXB9基因属于肿瘤抑制因子，沉默的HOXB9基因在甲状腺乳头状癌增殖、侵袭中举足轻重，临床可将其作为甲状腺癌的治疗新靶点。由此证实，HOXB9基因可为恶病质疾病治疗提供新思路。

MGMT属于DNA修复酶，可帮助染色体躲避烷化剂的损伤，MGMT可有效修复被烷基化的鸟嘌呤，阻止DNA交链形成，从而达到降低化疗药物细胞毒性〔15〕。P-gP在具有分泌与排泄双重功能的细胞膜上分布，主要生理作用即维持器官正常生理作用、运输、转化激素、调节细胞吞噬、排泄代谢产物、药物解毒等〔16〕。P-gP属于能量依赖性药物输出泵，不仅存在与抗肿瘤药物的结合位点，也含有ATP结合位点，因此，P-gP一旦结合某种抗肿瘤药物，便可通过ATP产生能量，将抗肿瘤药物泵出病灶细胞，而病灶细胞内抗肿瘤药物浓度变化因此下降，药物的抗肿瘤作用因此削弱，抗肿瘤药物的耐药性因此出现〔17〕。hMLH、hMSH2是参与错配修复功能的主要基因，对控制基因突变与维持DNA复制保真度意义重大，在错配修复系统中任意一个基因突变都可造成细胞错配修复功能丢失，出现复制错误或不稳定〔18〕。本研究结果表明HOXB9基因的表达情况可能与脑胶质瘤患者采取替莫唑胺化疗时产生耐药性有关。HOXB9基因阳性表达率高可能是造成脑胶质瘤患者采取替莫唑胺化疗时产生耐药性的影响因素。鉴于此，临床可在脑胶质瘤患者开展替莫唑胺化疗前，通过对HOXB9基因异常表达进行及时合理干预，旨在降低脑胶质瘤患者开展替莫唑胺化疗时的耐药率。但本研究纳入的样本数量较少，研究结论缺乏临床论据证实，因此，本研究结论的可信度还需在未来开展更多的相关性研究加以验证，旨在指导临床脑胶质瘤患者的化疗。

综上所述，HOXB9基因与P-gP、MGMT、hMLH、hMSH2诸多耐药分子之间关系密切，HOXB9基因可能是造成脑胶质瘤患者开展替莫唑胺化疗时产生耐药的危险因素，在开展替莫唑胺化疗前，可通过监测脑胶质瘤患者体内HOXB9基因表达情况，针对异常表达者，及时干预治疗，旨在降低脑胶质瘤患者开展替莫唑胺化疗时的耐药率。