双酶酶解制备黑小麦麸皮抗氧化肽

赵妍，路清宇

河南工业大学粮油食品学院（郑州 450001）

黑小麦麸皮是一种优质的蛋白资源[1]，将黑小麦麸皮蛋白进行酶解得到具有抗氧化能力的活性肽，是一种开发麦麸蛋白的有效途径。试验采用黑小麦提取麸皮蛋白，通过双酶分步酶解制得抗氧化肽，使用单因素试验和正交法优化提取工艺，为黑小麦麸皮抗氧化肽的理论研究及其相关产品的开发提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑小麦（农大876），泰安绿得农业有限公司；碱性蛋白酶（200 000 U/g）、风味蛋白酶（30 000 U/g）、木瓜蛋白酶（800 000 U/g）、中性蛋白酶（60 000 U/g）、胰蛋白酶（250 000 U/g），北京索莱宝生物科技有限公司；总抗氧化能力测试盒、总蛋白定量测试盒，南京建成生物工程研究所；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

TGL-18MS高速冷冻离心机，上海卢湘仪器有限公司；Phs-3c酸度计，上海大普仪有限公司；LGJ-10C型冷冻干燥机，北京四环科学仪器厂；TV-1819型紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限公司；Multiskan FC型酶标仪，赛默飞世尔仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黑小麦麸皮蛋白的提取

黑小麦润麦磨粉得到麸皮，粉碎后过孔径0.250 mm筛，加蒸馏水调节至料液比为1∶15（g/mL）后，调节pH到9，55 ℃振荡60 min，离心（3 600 r/min）30 min取上清液，残渣重复上述步骤。将2次上清液混匀，调节pH至4.8，离心（3 600 r/min）30 min，取沉淀冷冻干燥。

1.3.2 黑小麦麸皮蛋白的酶解

黑小麦麸皮蛋白加蒸馏水至浓度2%，调节pH，37 ℃搅拌15 min，加入酶进行酶解，控制时间和温度，结束后将其置于92 ℃灭酶10 min，8 000 r/min离心15 min，取上清液测水解度、肽得率及总抗氧化活性。用最优条件将第一步酶解进行至灭酶后，加入第二步酶进行酶解，重复上述操作测定3种指标，上清液冷冻干燥。

1.3.3 水解度（DH）测定

采用茚三酮比色法[2]。酶解液8 000 r/min离心15 min，取2 mL上清液，加入0.5 mL pH 8.04磷酸盐缓冲液及0.5 mL 2%茚三酮溶液，沸水浴反应15 min，冷却至室温，加蒸馏水定容至25 mL，摇匀静置15 min，波长570 nm处比色，以空白试剂为参比，按式（1）进行计算。

式中：A为查表得蛋白质的毫克数；m为称样质量，g；V1为水解液的总体积，mL；V2为稀释液的体积，mL。

1.3.4 总抗氧化活性（Trolox value）测定

根据总抗氧化活性试剂盒（ABTS快速法）测定[3]。依次加入10 μL样品、20 μL过氧化物酶应用液及170 μL ABTS工作液于96孔板，室温条件下反应6 min，使用酶标仪在波长405 nm处读取各孔OD值。以蒸馏水为空白对照，Trolox为标准品，按式（2）进行计算。

式中：总抗氧化活性，μmol/g；cTrolox为样品相当于Trolox的浓度，将OD值代入Trolox标准曲线得出，mmol/mL；m为黑小麦麸皮蛋白的质量，g；V为反应液的总体积，mL；n为稀释倍数。

1.3.5 肽得率的测定

根据总蛋白定量测试盒（BCA法）测定[4]。依次加入20 μL样品、双蒸水、563 μg/mL标样、250 μL工作液，混匀后37 ℃孵育30 min，加入750 μL终止剂应用液，再次混匀，静置5 min后用双蒸水调零。波长562 nm、光径0.5 cm处测定其吸光度。

式中：ODs为测定OD值；ODb为标准OD值；OD0为空白OD值；标样浓度为563 μmol/mL；n为稀释倍数。

1.3.6 单因素试验

采用5种蛋白酶酶解，条件设定为表1，根据水解度、总抗氧化活性及肽得率，筛选出两步酶解所用的蛋白酶进行单因素试验及正交优化试验。

改变温度（30，40，50，60和70 ℃）、pH（7，8，9，10和11）、时间（0.5，1，1.5，2，2.5和3 h）及酶添加量（6 000，10 000，14 000，18 000和22 000 U/g）中的1个因素，测定3种指标，选出第1种酶酶解时各因素最适宜的水平。采用第1种酶的最佳酶解参数进行酶解并灭酶后，加入第2种蛋白酶继续酶解，同样改变温度（30，40，50，60和70 ℃）、pH（4，5，6，7和8）、时间（0.5，1，1.5，2和2.5 h）及酶添加量（2 000，6 000，10 000，14 000和18 000 U/g）中的1个因素，测定3种指标，选出各因素最适宜的水平。

表1 不同蛋白酶的水解条件

1.3.7 正交优化试验

参照单因素试验结果，以pH、温度、时间及酶添加量为自变量，水解度、总抗氧化活性以及肽得率为因变量，设计四因素三水平试验，各因素水平见表2和表3。

1.3.8 数据处理

试验重复3次，分析时采用平均值计算。使用SPSS 20.0进行单因素及其方差分析，使用正交设计助手Ⅱ v3.1软件进行正交分析，使用Origin 8.5软件进行作图。

表2 第一步正交试验设计水平编码表

表3 第二步正交试验设计水平编码表

2 结果与分析

2.1 蛋白酶的选择

由图1可知，经碱性蛋白酶酶解，肽得率和总抗氧化活性均明显高于其余3种酶，水解度仅次于风味酶，因此选碱性蛋白酶为第一步水解用酶。经风味酶酶解，水解度最高，总抗氧化活性仅次于碱性蛋白酶，所以选风味酶为第二步水解用酶。

图1 酶种类对水解度、总抗氧化活性及肽得率的影响

2.2 碱性蛋白酶单因素试验结果

2.2.1 温度对水解度、总抗氧化活性及肽得率的影响

由图2可知，温度较低时，3种指标均随温度升高而升高；而温度超过50 ℃，则3种指标均呈下降趋势。这是因为蛋白酶有自身的有效温度及最适温度，在有效温度范围内才具有酶解催化作用；在最适温度下，其酶活性最强，催化酶解效果最佳[5]。温度过高或过低时，酶活性不佳，不利于多肽的生成，使得水解度与肽得率降低，影响抗氧化活性，因此将50 ℃定为碱性蛋白酶酶解的最佳温度。

2.2.2 加酶量对水解度、总抗氧化活性及肽得率的影响

由图3可知，酶添加量较少时，3种指标均逐渐升高；酶添加量从18 000 U/g升高到22 000 U/g时，3种指标基本保持稳定。这是因为底物浓度不变时，酶添加量决定了酶解后多肽的生成量，当足够的酶与底物反应后，多肽的生成量最高[6]，此时底物可能已经被酶解完全，因此选择18 000 U/g作为酶解的最适添加量。

图2 温度对水解度、总抗氧化活性及肽得率的影响

图3 加酶量对水解度、总抗氧化活性及肽得率的影响

2.2.3 时间对水解度、总抗氧化活性及肽得率的影响

由图4可知，当酶解时间较短时，3种指标均逐渐升高，酶解时间高于2 h后，3种指标均保持稳定。这是因为酶解时间较短时，底物中酶解位点充足，反应速度快，水解度等相关指标增加较快[5]；酶解时间延长后，底物中酶解位点变少，反应速度变慢，3种指标均逐渐达到了最大值；此后一些多肽又被进一步酶解，降低了酶解产物的总抗氧化活性[7]。因此酶解最佳时间为2 h。

图4 时间对水解度、总抗氧化活性及肽得率的影响

2.2.4 pH对水解度、总抗氧化活性及肽得率的影响

由图5可知，当pH较低时，3种指标均逐渐增加，pH超过9后3个指标均呈下降趋势。这是因为pH会影响氨基酸残基的解离状态，改变酶的空间结构，从而影响酶解进程[8]。当pH处于蛋白酶最适pH范围内时，酶的催化反应速度最快，效果最佳；而pH过高或过低易造成酶变性失活[5]。因此选择pH 9作为最适pH。

2.3 碱性蛋白酶正交试验结果

由表4～表7可知，3种不同条件分别对3种指标具有不同的显著与极显著影响。由表4可知，碱性蛋白酶酶解黑小麦麸皮蛋白的最优组合为A2B2C2D2，即pH 9，时间2 h，温度50 ℃，酶添加量18 000 U/g。选择该条件进行黑小麦麸皮蛋白的第一步酶解。

图5 pH对水解度、总抗氧化活性及肽得率的影响

表4 正交试验直观分析表

表5 水解度方差分析表

表6 肽得率方差分析表

表7 总抗氧化活性方差分析表

2.4 风味蛋白酶单因素试验结果

图6 温度对水解度、总抗氧化活性及肽得率的影响

图7 pH对水解度、总抗氧化活性及肽得率的影响

由图6和图7可知，当温度和pH较低时，3个指标均有一定的升高；处于50 ℃以及pH 6时，3个指标均到达最高值；而温度和pH继续升高，这3个指标均出现下降的趋势，因此将50 ℃和pH 6分别定为风味蛋白酶酶解的最佳温度和最适pH。

由图8和图9可知，当酶添加量较少及时间较短时，3个指标均呈现逐渐升高的趋势；当酶添加量从10 000 U/g升高到18 000 U/g，时间从1.5 h到2.5 h，3个指标均保持稳定，变化幅度较小。因此分别选择10 000 U/g和1.5 h作为风味蛋白酶的最适添加量和最佳酶解时间。

图8 加酶量对水解度、总抗氧化活性及肽得率的影响

图9 时间对水解度、总抗氧化活性及肽得率的影响

2.5 风味蛋白酶正交试验结果

由表8～表11可知，不同条件分别对3种指标具有不同的显著与极显著影响。由表8可知，风味蛋白酶酶解黑小麦麸皮蛋白的最优组合为A2B2C3D2，即pH 6，时间2 h，温度50 ℃，酶添加量10 000 U/g，选择该条件进行黑小麦麸皮蛋白的第二步酶解。

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接表8

试验号 A pH B温度 C时间 D加酶量 水解度/% 肽得率/% 总抗氧化活性/(μmol·g-1) k2 20.04 20.26 18.83 18.90 k3 17.65 17.91 19.09 18.46 R 2.39 2.95 1.53 0.78水解度 B＞A＞C＞D k1 41.21 39.75 40.45 40.85 k2 46.34 47.32 43.20 43.82 k3 40.06 40.54 43.95 42.93 R 6.29 7.57 3.50 2.97肽得率 B＞A＞C＞D k1 6.98 6.89 6.89 6.98 k2 7.63 7.63 7.33 7.31 k3 7.00 7.09 7.40 7.32 R 0.65 0.74 0.51 0.34总抗氧化活性 B＞A＞C＞D

表9 水解度方差分析表

表10 肽得率方差分析表

表11 总抗氧化活性方差分析表

3 结论

试验采用碱性蛋白酶和风味酶对黑小麦麸皮蛋白进行分步酶解。根据各自单因素试验进行正交优化，最佳工艺条件为第一步使用碱性蛋白酶酶解，pH 9，酶活添加量18 000 U/g，时间2 h，温度50 ℃；此时水解度为11.46%，肽得率为38.33%，总抗氧化活性为6.65 μmol/g。第二步使用风味酶酶解，pH 6，温度50 ℃，时间2 h，酶活添加量10 000 U/g；此时水解度为22.74%，肽得率为52.36%，总抗氧化活性为8.47 μmol/g。