茶树叶片中茶皂素提取工艺优化

姚玉仙，张明泽，刘丽萍，杨小礼

黔南民族师范学院生物科学与农学院（都匀 558000）

茶皂素（Tea saponin）又名茶皂苷，是一类齐墩果烷型五环三萜类皂苷的混合物，其基本结构由皂苷元、糖体、有机酸组成[1-2]。茶皂素的用途广泛，因其具有较强的发泡、乳化、分散、湿润、抗渗、消炎、镇痛、抗癌等作用，被广泛应用于化妆品、食品、医药、建筑等领域，可作为生物农药、农药增效剂、洗涤剂、食品添加剂、水泥减水剂和稳泡剂等[3]。中国茶叶资源丰富，2017年茶园面积与茶叶产量均居世界第一，但在传统茶叶出现产大于销的背景下，中低档茶和夏秋茶资源的利用率偏低，而茶叶深加工是提高茶资源利用率、茶产业规模与效益的重要途径，茶皂素生物活性理论研究与应用的不断深入将推动其相关功能产品的开发与市场拓展[4]。茶皂素的提取方法主要以水提及醇提为主[5]，水提法存在能耗高、分离困难、纯度低等缺点[6]，醇提取法因有机溶剂的比热容比水小，所以整个提取过程中能耗得到有效降低，并且提取率高、纯度优[7]。提取茶皂素的原料主要有油茶茶籽粕和茶壳等[8-10]，利用夏季茶树叶片作为原料提取茶皂素的研究报道较少。为了提高夏秋茶资源利用效率，试验以乙醇作为提取溶剂，考察液料比、乙醇体积分数、浸提温度、浸提时间等因素对夏秋茶叶片中茶皂素提取效果的影响，通过正交试验探索乙醇提取茶皂素的最佳工艺。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

于夏季采集茶树老叶片（都匀毛尖茶地方品种），烘干粉碎后过孔径0.180 mm筛，用自封袋保存备用。

无水乙醇、浓硫酸、香草醛（均为分析纯试剂）。

1.2 仪器与设备

L5S紫外可见分光光度计（上海析谱仪器有限公司）；2XZ-1型旋片式真空泵（浙江黄岩医疗器械厂）；RE-52AA旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；DK-8D电热恒温水槽（上海齐欣科学仪器有限公司）；101型电热鼓风干燥箱（北京科伟永兴仪器有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 茶皂素提取工艺流程

1.3.2 茶皂素提取方法

用电子天平称取5 g烘干至恒重的茶粉，置于250 mL锥形瓶中，按照单因素及正交试验工艺进行提取，趁热过滤，滤液回流浓缩至黏糊状，烘干至恒重，得茶皂素粗提物，称其质量计数。

1.3.3 茶皂素标准曲线绘制

以纯化的茶皂素为标准品，配制茶皂素标准溶液。称取0.01 g干燥标准品，用适量80%乙醇将其溶于10 mL容量瓶中，定容摇匀，标准溶液的质量浓度为1 mg/mL。采用浓硫酸-香草醛显色法[11]测定吸光度（A）。

茶皂素最大吸收波长的确定。用移液器精确吸取1 mL标准溶液，置于10 mL容量瓶中，加入0.5 mL 8%香草醛乙醇溶液和4 mL 77%硫酸溶液，用去离子水定容，摇匀。混合物于60 ℃加热15 min，冰水冷却10 min后，取出放至室温。以试剂空白为参比，在400～ 700 nm波长下测定茶皂素吸收光谱，茶皂素的最大吸收波长为452 nm（图1）。

图1 茶皂素吸收光谱

标准曲线的绘制。取0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mL茶皂素标准溶液于10 mL容量瓶中，按确定茶皂素最大吸收波长的方法加入其他试剂，在452 nm波长下测定吸光度。以茶皂素质量浓度（C）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，建立茶皂素质量浓度与吸光度的关系曲线（图2），其回归方程为A=5.631 4C+0.001 4，R2=0.995 9。

图2 茶皂素标准曲线

1.3.4 粗提物中茶皂素含量测定及茶叶中茶皂素得率计算

称取0.5 g烘干至恒重的茶皂素粗提物，置于10 mL容量瓶中，加适量80%乙醇使之溶解，定容摇匀，即得供试溶液。用移液器吸取1 mL供试溶液加入10 mL容量瓶中，吸光度测定参照1.3.3中标准曲线绘制步骤。粗提物中茶皂素含量（ω）利用式（1）计算，茶叶中茶皂素得率（Y）利用式（2）计算。

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式中：A为吸光度；V为测定用供试溶液体积；N为稀释倍数；m为茶皂素粗提物干质量，g；M为提取所用茶粉干质量，g。

1.3.5 单因素试验

以粗提物中茶皂素含量和茶叶中茶皂素得率为试验指标，选取液料比、乙醇体积分数、浸提温度和浸提时间4个因素进行单因素试验。各因素水平的设计见表1。各单因素试验的基本条件为：液料比20∶1（mL/g）、乙醇体积分数60%、浸提温度60 ℃、浸提时间1.5 h。

表1 单因素试验各因素及水平

1.3.6 正交试验

在单因素基础上，对液料比、乙醇体积分数、浸提温度和浸提时间4个因素选用L9(34)正交表设计正交试验，优化夏季茶树老叶中茶皂素的提取工艺。具体因素水平见表2。

表2 正交试验因素水平表

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果分析

2.1.1 液料比对粗提物中茶皂素含量及茶叶中茶皂素得率的影响

由图3可知，液料比10∶1（mL/g）时，粗提物中茶皂素含量最高，为13.85%。液料比10∶1～20∶1（mL/g）时，粗提物中茶皂素含量随液料比增加而下降；液料比大于20∶1（mL/g）时，粗提物中茶皂素含量趋于稳定。液料比30∶1（mL/g）时，茶叶中茶皂素得率最高，为2.76%。液料比越大，传质推动力越大，提取速度越快，茶叶中茶皂素得率越高。但是随液料比增大，可溶性物质溶出量增加，导致粗提物中茶皂素含量降低；同时，溶剂的使用量增加，浓缩时间延长，成本增加。因此，考虑提取的经济成本及茶皂素粗提物纯化的难度，选择液料比10∶1～20∶1（mL/g）为宜。

2.1.2 乙醇体积分数对粗提物中茶皂素含量及茶叶中茶皂素得率的影响

由图4可知，乙醇体积分数70%时粗提物中茶皂素含量和茶叶中茶皂素得率均最高，分别为12.43%和2.78%。随乙醇体积分数增大，两者均呈先增加后降低的趋势，这可能与茶皂素更易溶于极性大小与其相似的乙醇溶液中有关。乙醇体积分数小于70%利于易溶于水的蛋白质和糖等杂质析出，粗提物中茶皂素含量及茶叶中茶皂素得率均降低。因此，乙醇体积分数选择60%～80%为宜。

图3 液料比对粗提物中茶皂素含量及茶叶中茶皂素得率的影响

图4 乙醇体积分数对粗提物中茶皂素含量及茶叶中茶皂素得率的影响

2.1.3 浸提温度对粗提物中茶皂素含量及茶叶中茶皂素得率的影响

由图5可知，温度60 ℃时粗提物中茶皂素含量和茶叶中茶皂素得率均最高，分别为12.34%和2.66%。随温度增高，两者总体均呈先增加后降低的趋势。随着温度升高，茶皂素的溶解度增加，温度达到60 ℃时，茶皂素浸出率最大。随温度继续增高，乙醇更易挥发，同时杂质溶出量增加，导致粗提物中茶皂素含量及茶叶中茶皂素得率下降。因此，温度选择60～80 ℃为宜。

图5 温度对粗提物中茶皂素含量及茶叶中茶皂素得率的影响

2.1.4 浸提时间对粗提物中茶皂素含量及茶叶中茶皂素得率的影响

由图6可知，浸提时间1.5 h时粗提物中茶皂素含量和茶叶中茶皂素得率均最高，分别为12.34%和2.67%。随浸提时间延长，两者总体均呈先增加后降低的趋势。浸提时间大于1.5 h时，杂质逐渐溶出，溶液中溶质浓度趋于饱和，浸提速率减慢，茶皂素得率下降。因此，浸提时间选择1～2 h为宜。

图6 浸提时间对粗提物中茶皂素含量及茶叶中茶皂素得率的影响

2.2 正交试验结果分析

茶皂素提取正交试验结果如表3所示。

表3 茶皂素提取正交试验结果

由表3可知，就粗提物中茶皂素含量而言，茶皂素提取工艺的影响因素主次顺序为A＞C＞B＞D，即液料比与浸提温度影响较大，乙醇体积分数与浸提时间影响较小，提取茶皂素的最佳工艺为A3B3C2D3，即液料比20∶1（mL/g）、乙醇体积分数80%、浸提温度70 ℃、浸提时间2 h；就茶叶中茶皂素得率而言，茶皂素提取工艺的影响因素主次顺序为A＞B＞D＞C，即液料比影响最大，其次为乙醇体积分数，浸提时间和浸提温度影响较小，提取茶皂素的最佳工艺为A3B1C3D3，即液料比20∶1（mL/g）、乙醇体积分数60%、浸提温度80 ℃、浸提时间2 h。

根据综合平衡法，由极差值大小可知，影响粗提物中茶皂素含量的关键因素是A和C，故最优水平组合为A3C2；影响茶叶中茶皂素得率的关键因素是A和B，故最优水平组合为A3B1。因此，提取夏季茶树叶片中茶皂素的最佳工艺为A3B1C2D3，即液料比20∶1（mL/g）、乙醇体积分数60%、浸提温度70 ℃、浸提时间2 h。

3 结论

利用乙醇浸提法对夏季茶树叶片中茶皂素的提取工艺进行优化，得出最佳的提取工艺：液料比20∶1（mL/g）、乙醇体积分数60%、浸提温度70 ℃、浸提时间2 h。我国夏秋茶资源丰富，试验结果为其作为茶皂素提取原料提供试验指导，对于拓展茶产业链、增加茶产品的附加值具有重要意义。