稀有人参皂苷Rg5的高效制备方法

张仔豪，叶安琪，成乐琴

吉林化工学院化学与制药工程学院（吉林 132022）

人参为五加科多年生草本植物，在我国有数千年的药用历史，具有抗肿瘤、抗衰老、抗心律失常、抑制细胞凋亡、降糖降脂、改善学习记忆、增强性功能和免疫功能等方面的作用[1-4]，广泛用于医药领域、保健食品和功能食品[5-9]。人参含有人参皂苷、人参多糖、挥发油（萜类、醇类、脂肪酸类等）和氨基酸等化学成分[10]，其中人参皂苷被视为人参最重要的标志性成分[11]。人参皂苷是一种固醇类糖苷化合物，一定条件下通过糖苷键的修饰可以转化成为次级稀有人参皂苷。大量研究表明，次级人参皂苷比未经修饰的人参皂苷显示出更好的吸收和药理活性。例如人参皂苷Rg3显示出抑制肺癌细胞增值作用[12]、Rh2显示出抑制前列腺癌细胞PC3增殖作用[13]、C-K显示出抑制乳腺癌MCF-7细胞迁移和侵袭作用[14]等。

人参皂苷Rg5是比人参皂苷Rg3少1分子水的次级稀有人参皂苷，现代药理研究表明人参皂苷Rg5对抑制慢性皮炎[15]、改善肺部炎症[16]、抗乳腺癌[17]、促进血管生成和血管舒张[18]等方面具有良好的作用。从人参皂苷Rg3和Rg5的对比研究可见，人参皂苷Rg5在改善记忆[19]、抗癌作用（宫颈癌、胃癌、结肠癌、肺癌、肝癌）、益智作用[20-22]和抗氧化方面的作用[23]均优于人参皂苷Rg3，并且具有与后者类似的免疫提高作用[24]。相比人参皂苷Rg3已经成功开发成为一类抗癌药物“参一胶囊”相比，人参皂苷Rg5的研究还非常滞后，因此有必要对人参皂苷Rg5的高效制备进行深入研究。

原人参二醇组皂苷（简称PPD型人参皂苷）经不同糖苷键的结构修饰，可以得到众多结构不相同的次级人参皂苷（见图1）。Rg5是PPD型人参皂苷的众多结构修饰产物中的一种，显然，如何通过提高人参皂苷Rg5的选择性和稳定性来提高人参皂苷Rg5收率是非常值得探究的问题。目前PPD皂苷经结构修饰制备人参皂苷Rg5往往采用水溶剂和有机弱酸[25-26]，不仅原料处理量少、而且生成大量的人参皂苷Rg3导致收率普遍较低。以PPD型皂苷为原料，以无机强酸盐酸为催化剂，95%乙醇为溶剂，以原料转化率和人参皂苷Rg5的收率为考察指标，研究人参皂苷Rg5的制备方法，并通过单因素和正交试验优化制备条件，探索一条高效方便地制备人参皂苷Rg5的工艺条件。

图1 PPD型人参皂苷的结构修饰次级皂苷结构式

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

DK-98-Ⅱ型恒温水浴锅，天津市泰斯特仪器有限公司；RE-52C型旋转蒸发仪，巩义市予华仪器有限责任公司RE-52C；P2303型高效液相色谱仪，大连依利特分析仪器有限公司；反向色谱柱PinnacleⅡ C18（250 mm×4.60 mm，5 μm），Restek U.S。

P P D 皂苷，自制；人参皂苷标准品R b1（纯度≥98%）、Rb2（纯度≥98%）、Rb3（纯度≥ 98%）、Rc（纯度≥98%）、Rd（纯度≥98%）、Rg5（纯度≥98%），成都曼斯特公司；乙腈（色谱纯），瑞典欧森巴克化学公司；甲醇（色谱纯），天津市永大化学试剂有限公司；盐酸（分析纯）、乙醇（分析纯）等，天津市永大化学试剂有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 原人参二醇组皂苷的分离

向处理好的D101C大孔吸附树脂中加入15 mg/mL的人参根总皂苷溶液，于60 ℃静态吸附12 h。再将已吸附有人参皂苷的D101C大孔吸附树脂用蒸馏水反复洗涤，依次使用35%和80%乙醇水溶液于25 ℃下静态解吸12 h，将80%乙醇解析液用旋转蒸发仪蒸干，所得残留物用适量的70%乙醇溶解，磁力搅拌下缓慢加入丙酮，经过滤、干燥得PPD皂苷原料。

1.2.2 单因素试验优化

取5个编号为1～5的小玻璃瓶，分别加入100 μL质量浓度为20 mg/mL的PPD皂苷的95%乙醇溶液，并加入一定浓度的95%乙醇盐酸溶液，水浴加热数小时。反应结束，加入适量的饱和碳酸钠溶液至pH 6.0左右，在45 ℃下用旋转蒸发仪蒸干，残留物中加入6 mL色谱纯甲醇溶解，用0.45 μm滤膜过滤，进行HPLC分析，分别计算原料中各单体皂苷的转化率和人参皂苷Rg5的收率。

1.2.3 正交试验

在单因素试验基础上，选取反应温度（A）、反应时间（B）、酸量（C）为考察因素，根据L9(34)正交表设计试验。因素水平表如表1。

表1 因素水平表

1.2.4 HPLC分析方法

试验中采用的色谱条件为：色谱柱PinnacleⅡC18（250 mm×4.60 mm，5 μm）；流速，1.0 mL/min；检测波长，203 nm；柱温，35 ℃；进样量，20 μL；流动相A，乙腈；流动相B，纯净水（超声除气处理）。梯度洗脱程序：0.00～10.00 min，A 22%；10.00～20.00 min，A 22%～27%；20.00～25.00 min，A 27%～31%；25.00～45.00 min，A 31%～38%；45.00～60.00 min，A 38%～52%；60.00～65.00 min，A 52%；65.00～75.00 min，A 52%～55%；75.00～77.00 min，A 55%～60%；77.00～77.10 min，A 60%～90%；77.10～97.00 min，A 90%；97.00～97.10 min，A 90%～22%；97.10～110.00 min，A 22%。

2 试验结果与讨论

2.1 PPD皂苷的制备

人参根总皂苷通过D101C大孔吸附树脂静态吸附与静态解吸，并结合丙酮沉淀法沉淀，分离得到PPD原料，经HPLC定量分析结果表明，PPD皂苷含量为92.33%，其中单体人参皂苷Rb1、Rc、Rb2、Rb3和Rd的含量分别为46.55%，13.43%，17.42%，4.26%和10.66%。HPLC分析见图2。

图2 原人参二醇组皂苷PPD液相色谱图

2.2 单因素试验优化人参皂苷Rg5的制备方法

2.2.1 盐酸浓度对制备人参皂苷Rg5的影响

在质量浓度为20 mg/mL的PPD型人参皂苷溶液（溶剂为95%的乙醇）中，依次加入等体积的用95%乙醇配制的0.01～0.05 mol/L浓度的盐酸溶液，在70 ℃反应3 h。反应产物的HPLC定量分析结果见图3。

图3 酸浓度对原料的转化率和人参皂苷Rg5收率的影响

从原料中各种单体人参皂苷的转化率来看，当酸浓度为0.01 mol/L时，除了人参皂苷Rc和Rb3全部参与反应以外，人参皂苷Rb1、Rb2、Rd均有剩余。HPLC定量分析结果表明，在该反应条件下人参皂苷Rb1的转化率为86.61%，而Rb2和Rd的转化率分别为90.81%和80.71%，表明这3种皂苷还有约10～20%没有参加反应；酸浓度进一步增加到0.02 mol/L或以上时，原料中所有单体皂苷的转化率全部可以达到100%。从酸浓度对人参皂苷Rg5的收率影响来看，酸浓度为0.01 mol/L时Rg5的收率最高可达到48.91%，而随着酸浓度的进一步增加，Rg5的收率逐渐下降，说明酸浓度的提高一方面可以提高原料的转化率，另一方面还会促进人参皂苷Rg5的进一步分解。因此结合人参皂苷Rg5的收率和原料的转化率，选择0.01 mol/L的盐酸溶液进行了进一步的工艺条件优化。

2.2.2 盐酸用量对制备人参皂苷Rg5的影响

在100 μL质量浓度为20 mg/mL的PPD型人参皂苷溶液（溶剂为95%的乙醇）中，依次加入50～150 μL的用95%乙醇配制的0.01 mol/L浓度的盐酸溶液，在70 ℃反应3 h。反应产物的HPLC定量分析结果见图4。

由图4可见，酸量对反应的影响非常显著。当酸量为50 μL时，原料中所有的皂苷都有大量的剩余，但随着酸量的增加，人参皂苷Rc，Rb3，Rb2，Rd和Rb1的转化率依次达到100%，而且当酸量为150 μL时，原料中所有皂苷的转化率均可达到100%。而酸量对人参皂苷Rg5收率的影响显示，酸量在50～125 μL范围内，人参皂苷Rg5的收率随酸量的增加而升高，而进一步增加酸量时，Rg5的收率有所下降，即显示出先增后降趋势。

图4 酸量对原料的转化率和人参皂苷Rg5收率的影响

2.2.3 反应温度对制备人参皂苷Rg5的影响

在100 μL质量浓度为20 mg/mL的PPD型人参皂苷溶液（溶剂为95%的乙醇）中，依次加入125 μL的用95%乙醇配制的0.01 mol/L浓度的盐酸溶液，分别在60～80 ℃反应3 h。反应产物的HPLC定量分析结果见图5。

由图5可知，当反应温度为60 ℃时，只有含量极低的Rb3的转化率为100%以外，其它单体皂苷的转化率基本在65%～80%之间，但随着反应温度的升高，转化率逐渐提高，而且人参皂苷Rc，Rb2，Rd和Rb1的顺序依次达到100%的转化率，并在75 ℃反应温度下所有皂苷的转化率均达到100%。反应温度对人参皂苷Rg5的收率影响方面，刚开始，随反应温度的升高而升高，而且温度到70 ℃时收率达到最高值51.68%。如果反应温度继续升高，虽然可以加快原料的转化速度，但是因人参皂苷Rg5的分解加快，导致收率反而快速下降，因此选择70 ℃进行了进一步的条件优化。

图5 反应温度对原料的转化率和人参皂苷Rg5收率的影响

2.2.4 反应时间对制备人参皂苷Rg5的影响

在100 μL质量浓度为20 mg/mL的PPD型人参皂苷溶液（溶剂为95%的乙醇）中，依次加入125 μL的用95%乙醇配制的0.01 mol/L浓度的盐酸溶液，在70 ℃反应2.5～4.5 h。反应产物的HPLC定量分析结果见图6。

图6表明，原料中人参皂苷Rc、Rb2、Rb3和Rd在反应2.5 h时就可以达到100%的转化率（Rb1为89.34%），而含量最高的人参皂苷Rb1在反应3.5 h时达到100%的转化率。反应时间对人参皂苷Rg5的影响如同反应温度，也是先增后降。在反应2.5～3 h内，Rg5的收率增加，而进一步延长反应时间时，原料转化生成Rg5的反应变少，而更多的是次级皂苷Rg5的进一步降解反应，即Rg5的分解量大于Rg5的生成量，因此Rg5的收率逐渐下降。

图6 反应时间对原料的转化率和人参皂苷Rg5收率的影响

2.3 正交试验对制备人参皂苷Rg5的优化

在单因素试验基础上，以反应温度（A）、反应时间（B）和酸量（C）为考察因素，根据L9(34)正交表进一步优化了人参皂苷Rg5的制备工艺条件。正交试验结果及分析结果见表2。

由表2的极差分析可知，影响Rg5收率的因素主次顺序为A＞C＞B，即反应温度的影响大于酸量、大于反应时间；最优方案为A2B1C2，即反应温度为70 ℃，反应时间为3 h，酸量为125 μL，此时对产物的HPLC定量分析（见图7）结果表明，人参皂苷Rg5的收率可以达到52.32%，远远高于通过人参皂苷制备人参皂苷Rg5的已报道的文献水平[25-26]。

表2 正交试验结果分析

图7 最优方案液相色谱谱图

3 结论与讨论

综上分析可知，以盐酸为催化剂，95%的乙醇为溶剂，制备人参皂苷Rg5的优化条件为PPD皂苷质量浓度为20 mg/mL、盐酸浓度0.01 mol/L、酸量为125 μL、反应温度为70 ℃、反应时间3 h，此时PPD皂苷中Rb1的转化率为88.84%，Rc转化率为100%，Rb2转化率为100%，Rb3转化率为100%，Rd转化率为100%，Rg5的收率为52.32%。

人参皂苷Rg5的收率主要取决于原料的转化率、人参皂苷中糖苷键的修饰位置即选择性（见图1）以及人参皂苷Rg5的分解情况。一般来说，原料转化率和对糖苷键修饰选择性越高、Rg5的分解越少，Rg5的收率就越高。研究选择无机强酸作催化剂，提高了原料的处理量和转化率；采用乙醇作溶剂，提高了人参皂苷发生消除反应生成Rg5的选择性；通过优化制备条件，减少了人参皂苷Rg5的分解，从而有效提高了人参皂苷Rg5的收率。方法与Huang等[27]所报道的酒石酸催化制备人参皂苷Rg3、Rg5相比，一方面，原料PPD皂苷质量浓度由1 mg/mL提高到了20 mg/mL，即原料处理量提高到了20倍，而酸浓度由有机酸的0.8～ 1.5 mol/L降低到了0.01 mol/L，显著提高了制备效率，而且降低了成本；另一方面，孙成鹏[25]和杨凌[26]研究相比，提高了反应选择性，使人参皂苷Rg5的收率由30.77%和14.7%提高到52%以上。由此可见，方法操作简单，收率和制备效率高，适合实验室或工业上大规模生产，这对于研究人参皂苷Rg5的制备及其药理活性具有重要参考价值。