二代测序检测上行型与下行型鼻咽癌中高频突变基因的研究

李佳星 曹辉 张瑜 李勇 王姿 景楚滢 黄立敏

鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)发病率位于我国耳鼻喉恶性肿瘤之首[1]，常见于我国南方地区。其主要的治疗方法包括放疗、化疗、靶向及免疫治疗，目前局部晚期鼻咽癌患者的控制率仍较差，约25%的局部晚期患者发生远处转移[2]。因此，如何有效降低鼻咽癌的局部复发及远处转移对提高鼻咽癌患者治疗疗效具有重大意义。临床上，鼻咽癌可表现为上行型、下行型或混合型三种类型[3]。三种类型具有显著不同的临床特征。分析并寻找它们之间的分子差异，对鼻咽癌的分子分型、治疗选择、预后预测等相关机制研究均具有十分重要的意义。

近年来，基因测序广泛应用于癌症诊疗等领域，二代测序(Next-generation sequencing，NGS)具有高通量、高敏感性等优点[4]。利用NGS筛选鼻咽癌的致病基因，寻找并分析不同临床特征类型鼻咽癌的基因表达差异有望改进鼻咽癌的诊疗现状。本研究利用NGS技术对40例鼻咽癌患者病变组织DNA进行检测，挖掘并分析鼻咽癌侵袭转移相关基因，为探索鼻咽癌相关基因诊治提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象

收集2014年1月—2018年12月就诊于贵州省人民医院肿瘤科的40例鼻咽癌患者肿瘤组织，其中上行型鼻咽癌20例，为G1组，下行型鼻咽癌20例，为G2组。纳入标准：(1)经组织病理学诊断为鼻咽癌患者；(2)上行型鼻咽癌患者：局部损害严重，向上破坏颅底骨和颅神经；下行型鼻咽癌患者：局部损害较轻，无颅底骨和颅神经损害，颈部淋巴结多处转移或形成巨大肿块；(3)年龄范围为20～70岁，本研究40例患者年龄42～63岁，平均(49.76±6.62)岁；(4)临床病例资料完善，包括患者一般情况、病理资料、临床分期相关资料(血常规、生化、EB-DNA、胸部CT、腹部CT或超声、鼻咽部及颈部MRI、骨扫描等)、治疗过程(放化疗剂量及次数、靶向药物剂量及次数)、放化疗前后影像学对比资料。每例患者留取活检石蜡包埋组织样本。本研究通过医院医学伦理委员会的批准，所有受试者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 组织DNA的提取 采集鼻咽部活检组织石蜡包埋组织切片，活检组织留取3～5 μm厚度切片，经病理评估每张切片肿瘤细胞比例大于20%，储存于-20℃冰箱待用。采用DNA QIAamp FFPE组织试剂盒严格按照说明书提取石蜡包埋组织DNA，采用Nanodrop2000评估DNA质量，将提取好的DNA储存于-20℃冰箱待用。

1.2.2 NGS基因测序 使用人全外显子组序列捕获试剂盒SureSelect Human All Exon Kitversion 2，基因组DNA被随机片段化，并与探针杂交捕获、富集，然后采用Illumina高通量测序平台进行测序，每个样本的最小平均测序深度为50x。(1)文库制备：DNA片段化：提取基因组DNA，文库制备前使用Qubit system对基因组DNA进行质检；(2)质量检测：使用2100Bioanalyzer System和DNA1000 Assay运用Agilent2100 Expert软件选择合适的检测程序，输入样品编号和注释，加入样品，开始检测；(3)末端修复：使用SureSelect Library Prep Kit，ILM进行杂交及杂交后扩增；(4)生物信息学分析：测序完成后，下机数据fastq格式文件，采用BWA(Burrows Wheeler Aligner，Version 0.7.12)[5]序列比对软件将每个样本的原始测序碱基序列与人类参考基因组序列(hg19)进行比对，分别应用SOAPsnp和SAMtools[6]等软件检测单核苷酸变异和小片段插入/缺失。

1.2.3 高频突变基因的选择 剔除同义突变、非移码突变、既不是exonic也不是splicing类型的突变以及数据库人群频率≥2‰的突变，在此基础上挑选出频率≥5%且support reads≥4，深度≥40的高频突变。

1.2.4 鼻咽癌临床病理分期 根据AJCC(American Joint Committee on Cancer，美国癌症联合委员会)鼻咽癌TNM分期标准第七版对鼻咽癌标本进行分期。

1.2.5 KEGG信号通路分析 将G1组高频突变基因和G2组高频突变基因在DAVID数据库中进行分析，找到其参与的KEGG信号通路，为后续的研究提供理论基础。

1.3 数据统计与处理

运用Microsoft EXCEL进行数据汇总，SPSS 23.0进行数据统计分析，非正态分布计量资料数据用中位数(四分位间距)表示，组间比较采用Wilcoxon秩和检验；分类变量选择χ2检验，连续性校正卡方检验或Fisher精确检验，检验水准α=0.05，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 上行型鼻咽癌患者与下行型鼻咽癌患者间的临床特征的比较

两组临床特征见表1。

表1 上行型鼻咽癌患者与下行型鼻咽癌患者间临床特征的比较

2.2 上行型鼻咽癌与下行型鼻咽癌间的差异突变基因

通过NGS检测上行型和下行型鼻咽癌，共发现20种高频突变基因，其中BCL9L、COL4A2、LGR5、LSR、SPEG、ABCC2、ALPK2、ASB15、ASRGL1、ATXNAL、C5orf42、CCDC88A、CEBPZ、CELSR3、CEP290、COL6A5基因突变率上行型鼻咽癌患者高于下行型鼻咽癌患者，且差异有统计学意义(P<0.05)，CEP170B、ABCA13、CACNA1F、CELSR2基因突变率上行型鼻咽癌低于下行型鼻咽癌患者，且差异有统计学意义(P<0.05)。其中CEP170B基因在下行型鼻咽癌患者的突变率为57%，在上行型组中未检测到该基因的突变，该基因在下行型组鼻咽癌患者中的突变率明显高于上行型鼻咽癌患者(P<0.05)(图1)。

图1 G1与G2组基因突变情况

2.3 在下行型鼻咽癌中突变基因的信号通路

通过二代外显子测序，发现CEP170B基因趋向于在G2组出现；CACNA1F基因倾向于在G2组出现，其与MAPK信号通路有关(图2)。

图2 MAPK通路图

2.4 G1与G2组的肿瘤突变负荷关系

上行型鼻咽癌组与下行型鼻咽癌组的肿瘤突变负荷分别为1.93(0.99～3.61)和1.01(0.65～4.95)，差异无统计学意义(P=0.470)(图3)。

图3 G1与G2组的肿瘤突变负荷

2.5 上行型鼻咽癌与下行型鼻咽癌组肿瘤异质性(Mutant Allele Tumor Heterogeneity，MATH)的比较

上行型鼻咽癌和下行型鼻咽癌组肿瘤异质性分别为103.31(74.90～106.85)和104.89(89.56～108.21)，与上行型鼻咽癌组比较，下行型鼻咽癌组肿瘤异质性呈现更高一些的趋势，但上行型鼻咽癌组与下行型鼻咽癌组肿瘤异质性差异无统计学意义(P=0.885)(图4)。

图4 G1与G2组肿瘤异质性

3 讨论

随着精准医疗的提出和发展，基因突变的检测对于肿瘤患者的治疗及预后越来越有价值，传统的基因测序技术已逐渐不能满足临床的需求，二代测序的出现及发展为肿瘤研究者们探测肿瘤的基因突变谱提供了帮助，使人们对肿瘤基因组学有了进一步的认识，为肿瘤的早期诊断、治疗靶点的发现、疗效的评估、治疗的选择、预后的判断提供了新方向。二代测序能覆盖更多的基因和更全面的位点，且灵敏度高，通量高，速度快，并可以发现未知突变，从而逐渐成为当代临床检测与科研探索主流的技术方式，已获得了FDA的认可[7]。目前，直接测序法(又称基因序列分析法)被称为基因突变检测的“金标准”。

本研究发现在上行型鼻咽癌与下行型鼻咽癌中，基因突变率存在显著差异；在下行型鼻咽癌中发现的高频突变基因是CEP170B，该基因也被称为FAM68C、KIAA0284。尽管CEP170B蛋白的生物学功能尚不清楚，但它与CEP170相似，有相同的结构域，提示其具有磷脂酰化功能和细胞核亚细胞定位[8]，因此，CEP170B基因可能与细胞骨架组织和信号传导有关[9]，而细胞骨架与肿瘤的侵袭转移密切相关。由于它们的序列相似，所以Welburn等[10]将CEP170B称为CEP170相关(CEP170R)。CEP170是中心体的一部分，在微管组织中起作用，微管是高活力的结构，在细胞生长、膜泡运输和分裂中均具有重要作用[11-12]。中心体是哺乳动物细胞的微管组织中心，是细胞内一个无膜包被的小体积细胞器，由两个互为垂直的中心粒和中心粒外周基质组成，是微管聚集地。中心体也是纺锤体装配的场所，在有丝分裂过程中作为纺锤体的两极从而形成纺锤体，且对细胞的正常分裂有着重要作用。中心体的异常会导致染色体的非整倍性，引起细胞的异常分裂，导致肿瘤的发生。因此，对中心体相关蛋白及中心体相关基因的研究将是我们探讨癌症发生发展机制的重要内容，同时为寻找肿瘤的诊断和治疗提供新的思路。

肿瘤侵袭转移是一个复杂的动态的过程[13]，细胞骨架重组和改建参与了这一过程。已有研究证实，部分中心体相关蛋白家族的高表达与肿瘤的发生发展密切相关。据报道中心体相关蛋白55(Centrosomal protein 55，CEP55)的过表达能够增强细胞的迁移和侵袭能力[14]。许多研究表明CEP55在人咽喉癌[15]、乳腺癌[16]、头颈部鳞癌[17]、胶质瘤[18]、食管鳞癌[19]等实体肿瘤中存在过表达现象，CEP55的过表达与这些肿瘤的发生和不良预后均密切相关[16，20]。邱霓等[21]研究推测中心体相关蛋白70能够促进乳腺癌细胞发生侵袭转移。本文研究发现，CEP170B在下行型鼻咽癌中高突变，与CACNA1F基因一样倾向于在G2组出现，其与MAPK信号通路有关，MAPK介导肿瘤细胞粘附和运动，而肿瘤细胞粘附能力异常是发生转移的重要机制，从而推测CEP170B可能通过增强微管蛋白的重新组织，促进鼻咽癌细胞发生侵袭转移。鉴于本研究样本量较少，仍需要后续扩大样本量以及更严格的细胞学实验研究进行进一步的探讨。肿瘤突变负荷能有效预测免疫治疗的疗效，G1组与G2组肿瘤突变负荷无显著性差异，提示上行型鼻咽癌与下行型鼻咽癌的免疫治疗疗效差别不大。目前各肿瘤没有统一的肿瘤突变负荷截止值，Hellmann等[22]人在纳武单抗联合伊匹单抗一线治疗晚期非小细胞肺癌研究中将10 mut/Mb作为肿瘤突变负荷的截止值探索肿瘤突变负荷与免疫治疗疗效的相关性，肿瘤突变负荷小于10 mut/Mb时，免疫治疗与化疗疗效无显著差异。肿瘤突变负荷值越高，免疫治疗疗效越显著[23]。肿瘤的异质性是恶性肿瘤的特征之一，能够使肿瘤的生长速度、侵袭与转移、药物敏感性、放射治疗敏感性、预后等各方面产生差异[24]。本研究发现G1组与G2组肿瘤异质性无明显差异，但G2组异质性呈现更高一些的趋势，肿瘤异质性的表现之一是肿瘤的转移潜能。该结果提示上行型鼻咽癌和下行型鼻咽癌在治疗和预后上会产生一定的差异。肿瘤异质性使得肿瘤产生耐药，进而不断地推进肿瘤相关治疗方法。

综上所述，NGS技术在肿瘤中的应用在肿瘤的诊断、预后危险因素分层、治疗方式和靶向药物的选择等多方面展现出了广泛的前景。通过NGS技术进行相关基因的检测前景广阔，可以为患者找到更多治疗的机会，为疾病的研究和靶向新药的研发提供新视野，为个体化治疗提供新方案。本研究中检测上行型和下行型鼻咽癌患者病理组织DNA，发现CEP170B在下行型鼻咽癌的表达明显高于上行型鼻咽癌，而下行型鼻咽癌是颈部淋巴结转移并易发生远处转移的类型。鉴于本研究样本量较少，仍需要后续扩大样本量进行进一步验证和研究。该结果初步提示CEP170B基因在鼻咽癌中的高突变可能与其转移潜能密切相关，值得进一步深入研究。