3D 打印钛合金种植体的制备及其骨结合性能

王 蕊, 李美华, 周万琳

（吉林大学第二医院口腔科，吉林 长春 130041）

3D 打印技术亦称增量制造技术，是指将产品的数字模型文件先进行分层离散处理，然后通过激光照射等方式将金属和树脂等材料逐层叠加精确堆积构建该产品的空间结构［1-2］。选择性激光烧结（selected laser sintering，SLS）是其中一种经典方式［3-4］，是在数控环境中利用激光烧结粉末材料，逐层叠加最终累积成形。近年来，种植技术逐渐成为牙齿缺失首选的治疗方式，但是种植牙也存在材料价格昂贵和技术复杂等缺点，随着3D 打印技术应用在口腔种植领域的发展，可以满足种植牙的个性化要求，同时种植牙技术的发展越来越成熟，因而3D 打印种植体必将成为发展的趋势。因优良的机械、化学性能和生物相容性，钛（Ti）及钛合金材料被作为生物种植材料广泛应用［5］，其具有高强度-质量比、优越的耐腐蚀性、良好的生物相容性、耐久性、骨整合能力以及相对较低的弹性模量等优点，是医学领域应用最为广泛的材料，目前广泛应用于牙种植体的是Ti-6Al-4V（TC4）［6-7］。尽管国外有大量关于3D 打印种植体临床应用的研究［8-9］，但目前国内对于3D 种植体打印的临床应用尚无相应、统一的指导意见，仍需要更多诸如3D 打印种植体长期负载或远期生物学及机械并发症相关的研究证据来支持3D 打印种植体的长期稳定性［10］，从而推动相关部门出台标准或形成相应的指南，早日实现3D 打印种植体在国内外的临床推广与应用［11］。 本 研 究 通 过 对 比TC4 种 植 体 与 经 典Straumann 种植体骨结合性能的差异，以期为3D 打印种植体的临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要试剂和仪器6 月龄家兔由吉林大学基础医学院动物实验中心提供，动物使用许可证号：SYXK （吉） 2017-0003。饲养条件严格依照GB14925 进行，雌雄不限，体质量3.0～3.5 kg。Ti-6Al-4V ELI-0406 钛合金粉末（上海艾荔艾金属材料有限公司），Micro-90 清洗剂（上海上碧实验仪器有限公司），Straumann®种植体（吉林省圣诺商贸有限公司），75%酒精消毒液和名碘皮肤黏膜消毒液（山东利尔康医疗科技股份有限公司），生理盐水（石家庄四药有限公司），水合氯醛溶液和中性甲醛固定液（北京雷根生物技术有限公司），注射用五水头孢唑林钠（深圳华润九新药业有限公司），亚甲基蓝-酸性品红染色液（上海源叶生物科技有限公司），甲苯胺蓝染色液（北京华越洋生物科技有限公司）。EinScan-Pro+多功能手持式3D 扫描仪（杭州先临三维科技股份有限公司），RENISHAW AM250 金属增材制造系统（深圳智诚三维网络有限公司），Solid Works 2012 建模软件（美国Solid Works 公司），FEI Scios 扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）（赛默飞世尔科技有限公司），超声波清洗机和海德曼风冷灭菌器（吉林大学第二医院），NSK Surgic XT Plus 标准种植机（上海麦森医疗科技有限公司），Straumann®手术工具盒（吉林省圣诺商贸有限公司），YX932D 负压吸引器（上海五相仪器仪表有限公司），KD-BM Ⅱ电脑生物组织包埋机、Leica RM224 半自切片机、OLYMPUS BX51 金相显微镜、OLYMPUS DP73 数码显微照相装置和OLYMPUS cellSens 显微图像软件（吉林大学病理生物学教育部重点实验室提供），HH-2 数显恒温水浴锅（常州天瑞仪器有限公司），

1.2 TC4 种植体的制备采用本课题组前期实验方 法 制 备TC4 种 植 体［12］。将Straumann 组 织 水 平种植体（4.1 mm×10.0 mm） 置于白光LED 灯下，选择固定式自由扫描模式，使用EinScan-Pro+多功能手持式3D 扫描仪对Straumann 种植体实现逆向扫描，将扫描结果输出为STL 格式文件，建立原始数字模型。之后依照设计需要运用Solid-Works 2012 建模软件对原始数字模型进行表面修饰、结构优化和图形片切等处理，获得最终数字模型，保存为STL 格式文件备用。将储存有最终数字模型信息的STL 格式文件导入RENISHAW AM250 金属增材制造系统，读取数据后，以Ti-6Al-4V ELI-0406 钛合金粉末为底料进行打印。打印参数设置为高纯度氩气、层厚50 μm 和激光强度200 W 进行烧结，共打印30 个种植体试件（TC4 种植体）。成形的种植体清洁余留钛粉，喷砂去除结构缺陷，依次使用Micro-90 清洗剂、75%酒精及蒸馏水超声波震荡清洗10 min，最后高温高压消毒备用。

1.3 家兔双侧股骨区种植体模型建立“1.2”中制备的TC4 种植体为实验组（TC4 种植体组），Straumann 种植体为对照组（Straumann 种植体组），在6 只家兔双侧股骨区建立种植体模型，每侧股骨均植入1 颗TC4 种植体和1 颗Straumann 种植体，共植入12 颗TC4 种植体和12 颗Straumann种植体，并设置观察时间点为术后2、4 和8 周，预计每个时间点处死2 只家兔。

1.4 标本的固定和脱钙NaH2PO44 g、Na2HPO46.5 g 及37%甲醛100 mL，蒸馏水溶解后定容至1 L，配制为10%中性甲醛溶液。甲酸100 mL，蒸馏水混匀后定容至1 L，配制为10%甲酸溶液。分别取等量10%中性甲醛溶液与10%甲酸溶液均匀混合，配制为10%甲酸-中性缓冲甲醛脱钙液，现配现用。于术后2、4 和8 周采用过量麻醉法分别处死家兔，暴露股骨上段，完全清理骨面附着的软组织后，截取种植体周围0.5 cm 范围以内硬组织制成标本，立即置入10% 中性甲醛溶液，固定1 周。固定完成后，流动水漂洗4 h，按照标本与脱钙液1∶30 的体积比，将骨块置入10%甲酸-中性缓冲甲醛脱钙液内脱钙，脱钙液更换周期为48 h，直至针刺入硬组织时阻碍明显减小，即标志脱钙完成。常规包埋切片，备用。

1.5 甲苯胺蓝染色检测2 组种植体骨结合界面新骨形成及骨组织修复情况切片脱蜡至水： 二甲苯Ⅰ、Ⅱ依次脱蜡40 min；系列乙醇浸润水化：无水乙醇2 次，每次10 min；95% 乙醇2 次，每次5 min；80%乙醇1 次5 min。蒸馏水水洗2 次。浸染于甲苯胺蓝工作液中30 min；蒸馏水冲洗3 min；0.5%冰乙酸工作液分化，至细胞核和颗粒清晰可见；切片脱水、透明和封片：95%乙醇快速脱水；无水乙醇脱水2 次，每次5 min；二甲苯透明2 次，每次10 min；中性树胶封固切片。镜下观察2 组种植体骨结合界面新骨形成及骨组织修复情况。

1.6 亚甲基蓝-酸性品红染色检测2 组种植体骨结合界面新生骨形成和矿化情况切片脱蜡至水（同甲苯胺蓝染色）；60℃水浴环境下亚甲基蓝工作液浸染15 min，滤纸吸尽余留工作液；60℃蒸馏水漂洗1 min，干燥；加入酸性品红工作液浸染5 min，滤纸吸尽余留工作液；切片脱水、透明和封固（同甲苯胺蓝染色）。镜下观察2 组种植体骨结合界面新生骨和矿化骨情况。

1.7 术后TC4 种植体稳定性和生物相容性检测术后TC4 种植体取出后，进行干燥处理，采用离子溅射镀膜机喷金后，利用SEM 对种植体表面微观形貌进行观察，同时使用能量色散X 射线光谱仪（energy-dispersive x-ray spectroscopy，EDS）对TC4 种植体进行元素构成分析。

2 结 果

2.1 术后不同时间点2 组种植体骨结合界面新生骨形成及骨组织修复情况术后2 周，高倍镜下可见2 组紧贴种植体的骨组织边缘有胞核深染、胞浆呈淡蓝色的成骨细胞线性排列，未观察到明显的新骨形成。术后4 周，2 组种植体骨组织边缘均可观察到淡染的新生胶原纤维样结构，排列欠整齐，与原矿化骨组织界限不清。术后8 周，2 组靠近种植体一侧骨组织均有淡蓝色的新生类骨质形成，结构连续完整，内含大量骨细胞，与原矿化骨界限清晰。见图1。

2.2 术后不同时间点2 组种植体骨结合界面新生骨形成及矿化情况术后2 周，Straumann 种植体组种植体-骨组织界面可见因种植外科手术切割形成的骨缺损，2 组近种植体侧的骨接触面上可见胞核深染成蓝色的成骨细胞。术后4 周，2 组种植体与原矿化骨组织间均可见新形成且红染的类骨质结构。术后8 周，2 组种植体表面均可见深红色的新生骨组织，伴有一定程度的钙化形成，Straumann 种植体组钙化程度略优于TC4 种植体组，红染的原矿化骨与深红染的新生骨界限相对模糊。见图2。

图1 术后不同时间点2 组种植体骨结合界面骨组织甲苯胺蓝染色结果（×400）Fig.1 Results of toluidine blue staining of osseointegration interface bone tissue of implants in two groups at different time points after operation（×400）

2.3 术后TC4 种植体的稳定性和生物相容性术后8 周时，SEM 观察显示：完成体内实验的TC4种植体表面结构基本与术前TC4 种植体保持一致［12］，低倍镜视野下可见种植体表面无明显结构缺陷，散在分布有较大的孔隙结构；高倍镜视野下可见种植体表面存在致密的片层状结构及相互连通的孔隙结构（图3A）。EDS 扫描结果和元素分布结果显示：完成体内实验的TC4 种植体除含有与术前TC4 种植体［12］一致的Ti、铝（Al）、矾（V）、铁（Fe）、碳（C）和氧（O）等元素外，尚有常量元素钙（Ca）、锰（Mg）和微量元素硅（Si）散在分布于种植体表面（图3B 和图4）。

3 讨 论

目前普遍认为，支架材料最有利于新生骨再生形成的孔隙大小范围为200～1 000 μm［8-13］，传统技术通常难以控制种植体表面形成的孔隙大小和与孔隙率，且传统制造工艺成本高、效率低且性能差，已不能满足日益增长的医学种植体的需求。随着3D 打印技术的发展，现有的技术手段能够精确孔隙尺寸的形成，获得梯度孔隙率的多孔表面。

图2 术后不同时间点2 组种植体骨结合界面骨组织亚甲基蓝-酸性品红染色结果（×400）Fig. 2 Results of methylene blue-acid fuchsin staining of osseointegration interface bone tissue of implants in two groups at different time points after operation（×400）

图3 术后8周TC4种植体表面SEM(A)和EDS扫描图像（×10 000）Fig. 3 Pictures of SEM(A) and EDS scaning of TC4 implant surface at 8 weeks after operation (×10 000 )

图4 术后8 周TC4 种植体的EDS 分析Fig. 4 EDS analysis of TC4 implants at 8 weeks after operation

YU 等［14］采用3D 打印技术，制备了具有起伏宏观粗糙表面的Ti-6Al-4V 种植体，骨髓间充质干细胞在3D 打印种植体表面的黏附、增殖、成骨分化和血管生成因子表达水平均高于传统加工方法获得的种植体，体内研究也显示3D 打印种植体在早期表现出相对较好的骨整合性能，表明3D 打印钛合金具有良好的生物相容性、骨传导性和血管生成潜能，有望作为骨植入材料，与本实验结果有一致性。

组织学特殊染色法主要包括甲苯胺蓝染色法、亚甲基蓝-酸性品红染色法和Masson 染色法等，合适的染色法可以显示骨成熟状态和骨组织各种分化状态［15］。本研究结果显示：术后2 周时，经甲苯胺蓝染色和亚甲基蓝-酸性品红染色可观察到紧贴种植体的骨创边缘聚集有胞核深染、单层排列的成骨细胞，TC4 种植体组成骨细胞数量略少于Straumann 种植体组，虽然未见明显的骨质形成，但成骨细胞的募集展示了TC4 种植体和Straumann种植体周围均存在活跃且一致的成骨趋势，提示种植体周围骨修复进入所谓的骨传导阶段［16］，与BUSER 等［17］的研究结果相符合；术后4 周时，镜下观察到活跃的类骨质结构形成是这一时期的共同特征，而甲苯胺蓝染色亦可观察到淡染的新生胶原纤维样结构，排列欠整齐，与原矿化骨组织边界不清，可认为种植体周围骨修复已进入新生骨形成阶段［16］；术后8 周时，种植体周围骨修复开始进入缓慢的骨重建阶段［16］，甲苯胺蓝染色可在近种植体一侧观察到淡蓝色且连续完整的新生骨组织，新生骨与原矿化骨边界清晰，而亚甲基蓝-酸性品红染色则可见2 组种植体表面均有深红色的新生骨组织形成，但与红色的原矿化骨组织界限模糊，新生骨组织内伴有一定程度的钙化形成，可见有部分位点形成板层骨，且Straumann 种植体组在钙化程度上相对优于TC4 种植体组。本研究结果显示：TC4种植体植入家兔体内8 周后，SEM 扫描可见其表面结构与术前基本保持一致，高倍镜下仍可见种植体表面存在致密的片层状结构及相互连通的孔隙结构，提示SLS 技术成形的TC4 种植体具备优越的结构稳定性，术后8 周时在TC4 种植体和周围骨组织之间已显示出非常好的骨整合。亦有学者［18-19］提出不同理论，认为钛合金尤其是TC4，具有严重的生物惰性和释放Al 和V 等金属离子，影响骨愈合过程，为克服这些问题，可以进行表面改性等处理。

综上所述，3D 打印技术制备的TC4 种植体具备优越的结构稳定性和良好的生物相容性，并能够在体内形成与经典种植体一致且相近的种植体-骨结合能力，3D 打印技术是一种具有良好发展前景的新技术。