同源异型盒蛋白2B在外周神经母细胞性肿瘤中表达及临床意义

李静羽，高吉照.徐州医科大学附属徐州儿童医院 病理科，江苏 徐州 000；

2.徐州医科大学附属医院 儿童血液肿瘤专科，江苏 徐州 221000

外周神经母细胞性肿瘤(peripheral neuroblastic tumors，pNT)是小儿颅外最常见的恶性实体肿瘤之一[1]。国际神经母细胞瘤病理分类系统根据年龄、有丝分裂—核碎裂指数、施万间质数量和神经母细胞瘤分化程度，将pNT分为神经母细胞瘤、节细胞性神经母细胞瘤、节细胞性神经母细胞瘤结节型与节细胞性神经瘤[2-5]。pNT起病隐匿，难以发现，且恶性程度高，进展迅速，常早期发生远处转移，且病死率高[6]。因此，对pNT进行早期明确诊断具有重要意义。同源异型盒蛋白2B(paired-like homebox 2B，PHOX2B)作为一种自主神经系统发育的转录因子，表达于神经嵴起源的自主神经节(交感神经节、副交感神经节、肠神经节)、肾上腺髓质及颈动脉体，影响神经细胞的分化与干细胞的维持[7-8]。本研究通过免疫组化法检测pNT组织中PHOX2B的表达情况，旨在探讨其对pNT的发病年龄、组织分化及预后的意义。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验资料 收集2013—2019年徐州医科大学附属徐州儿童医院收治的30例经病理诊断明确、治疗规律、随访资料完整的pNT患者的病理组织。排除标准：在外院诊断后来院治疗者；无随访记录者。其中，男性12例，女性18例；年龄10 d至6岁，中位年龄2岁。另选取同期收治的27例非pNT的小圆细胞性肿瘤患者的病理组织作为对照。

1.2 主要试剂 一抗兔单克隆抗体PHOX2B购于上海Abcam公司，克隆号14 423，稀释浓度1∶1 000；二抗山羊抗小鼠/兔IgG复合物购于上海基因科技股份有限公司。光学显微镜型号Olympus BX43购于日本Olympus公司。

1.3 免疫组织化学染色 将组织常规包埋、切片、烤片、脱蜡、水化；内源性过氧化物酶阻断剂，室温孵育10 min；柠檬酸盐缓冲液抗原修复；滴加PHOX2B一抗，于4℃下孵育16 h。室温复温后，滴加酶标山羊抗小鼠/兔IgG复合物；二氨基联苯胺显色；苏木素复染、盐酸酒精返红、氨水返蓝；脱水、透明、封片。

1.4 染色判定标准 PHOX2B阳性结果判定标准：至少5%细胞存在核染色，PHOX2B染色主要定位于细胞核，阳性表达细胞判断为镜下组织细胞结构清晰，细胞质和/或细胞核有黄色颗粒沉着，且染色明显高于背景。阴性表达的细胞中细胞质被苏木素蓝染，棕黄色颗粒少见或缺如染色。在染色强度和同样物镜视野下的阳性细胞数乘积作为评分。染色强度分级：无着色为0分；浅黄色为1分；棕黄色为2分；3棕褐色为3分。按阳性细胞比例进行评分：阳性占比<5%为1分；阳性占比5%～50%为2分；阳性占比51%～75%为3分；阳性占比76%～100%为4分。取两项评分乘积判定结果：评分≤4分为低表达，评分>4分为高表达；12分为强阳性，中阳性为4～11分，分数<4分为弱阳性。

1.5 统计学方法 采用SPSS 19.0统计学软件对数据进行处理。计数资料用例(百分率)表示,组间比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

PHOX2B表达结果：pNT阳性表达率93.3%(28/30)。其中，强阳性22例(73.3%)、中阳性4例(13.3%)、弱阳性2例(6.7%)；阳性细胞比例评分4分22例(73.3%)、2～3分4例(13.3%)、1分2例(6.7%)；高表达23例(76.7%)，低表达5例(16.7%)。对照组27例全部为阴性。见图1。PHOX2B蛋白主要定位于细胞核内，并且其表达与pNT发病年龄、分化程度及预后均具有相关性(P<0.05)。见表1。

图1 PHOX2B在pNT不同分型及对照组中表达[a.pNT中神经母细胞瘤未分化型(200倍)；b.pNT中神经母细胞瘤未分化型(400倍)；c.节细胞神经母细胞瘤混合型中分化的肿瘤细胞PHOX2B表达(200倍)；d.原始神经外胚层肿瘤细胞PHOX2B染色阴性(200倍)；e.淋巴母细胞性淋巴瘤肿瘤细胞PHOX2B染色阴性(200倍)；f.髓母细胞瘤肿瘤细胞PHOX2B染色阴性(200倍)]

表1 PHOX2B表达与pNT患者临床病理特征关系/例(百分率/%)

3 讨论

pNT作为常见的儿科颅外实体肿瘤，主要发生在18个月左右的儿童时期[9]，最常见于肾上腺髓质，其次为腹部、胸部或头部和颈部。pNT临床表现多样，部分表现为肿瘤播散、转移，不给予治疗导致死亡，部分发展成熟为良性的节细胞神经瘤，甚至自发消退[10]。pNT属于小圆蓝细胞性肿瘤，存在未分化小圆细胞的组织形态，诊断困难，鉴别需生物学标记。常用神经源性标记物有Syn、CgA，但是这些标志物特异性不高，通常在其他小圆细胞肿瘤中也有表达[11-13]。此外，pNT的诊断在非典型病史或发生部位、有限的标本或压碎的标本、未分化或差分化型的形态学方面具有挑战性。所以寻找一种具有敏感性及特异性强的标记物至关重要。

在周围神经系统中，神经嵴细胞的维持以及神经元和神经胶质细胞谱系是由 Delta-Notch通路介导的侧向抑制决定的[13]。PHOX2B是调节 Delta-Notch 通路的关键因子，编码基因位于染色体 4p12，跨度4 888 bp，有一个3.0 kb 的转录本,编码314个氨基酸，包括一个同源结构域和两个同源异型片段，分别为9个和20个丙氨酸残基[14]。PHOX2B作为转录因子，与性别决定区盒子(the sex-determining region Y box10，SOX10)相互协调对神经嵴细胞的分化起引导作用[15-16]。本研究通过免疫组化的方法检测pNT中PHOX2B蛋白表达，表明PHOX2B表达强度与pNT肿瘤细胞的分化程度有关，分化程度越低，表达越强。本研究结果还发现，PHOX2B的表达与年龄有关，年龄≤18个月患者的高表达率为93.7%，明显高于年龄>18个月患者的57.1%。Bachetti等[17]对不同分化阶段的神经母细胞瘤进行PHOX2B基因检测发现，PHOX2B的低表达与良好的总体生存率有关。

综上所述，PHOX2B对pNT的诊断具有高度敏感性及特异性，可作为pNT可靠的诊断标记物；PHOX2B表达高低与发病年龄、肿瘤细胞分化程度及病理预后均相关，动态检测PHOX2B变化，有望成为判断pNT病情进展与否的重要指标。