脂联素对氯化钴诱导肾小管上皮细胞凋亡及炎症反应影响研究

郑晓彤，刘大军

中国医科大学附属盛京医院 肾内科，辽宁 沈阳 110004

缺血性肾病是肾动脉狭窄导致灌注压下降，使其超过了自动调节代偿能力而引起的缺血性肾损伤。肾缺血加剧会导致肾小管结构损伤，进一步加重肾功能损害，引发终末期肾病。肾组织缺血缺氧过程会引起氧化应激反应，进而产生大量的活性氧，其与肾组织细胞成分发生反应，引发细胞凋亡，而肾细胞大量凋亡会引起肾纤维化和炎症等病理损伤[1]。脂联素是一种脂肪细胞衍生血管活性肽，在调节能量代谢、炎症反应及心肌缺血中发挥重要作用。有研究发现，脂联素可通过激活STAT3，减少活性氧产生，起到保护心脏的作用[2]；脂联素敲除小鼠模型的心肌细胞凋亡及梗死面积明显增加，而外源性给予环形脂联素可明显降低上述影响[3]；重组脂联素蛋白还能够通过减少活性氧产生，增强抗氧化能力，进而发挥抗炎作用[4]。本研究旨在探讨脂联素对氯化钴诱导的肾小管上皮细胞凋亡及炎症反应的影响。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 人肾小管上皮细胞株HK-2细胞购于上海联众生物公司；脂联素(C552)购于中国近岸蛋白质科技有限公司；氯化钴(C8661)购于美国Sigma公司；南美胎牛血清，培养基DME/F-12、青-链霉素双抗均购于科硕商贸有限公司；MitoSOXTM Red Mitochondrial Superoxide Indicator试剂盒(M36008)购于美国赛默飞公司；DAPI(4083S)购于美国CST公司；流式凋亡检测试剂盒(556547)购于美国BD公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒、RIPA裂解液、PMSF、SDS-PAGE凝胶试剂盒均购于碧云天生物技术有限公司；双色预染蛋白Marker(26616)购于美国赛默飞公司；一抗抗体白细胞介素(interleukin，IL)-1β(YT2322)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α(YT4689)均购于美国Immunoway公司；IL-6(A0286)购于ABclonal公司；β-tubulin(66240-1-Ig)购于中国Proteintech公司；二抗抗体购于中国Proteintech公司。

1.2 仪器 高速冷冻离心机(德国Thermo公司)；荧光显微镜、全光谱激光共聚焦显微镜(日本尼康公司)；流式细胞检测分析仪(美国BD公司)；Western Blot电泳仪、电转仪(美国Bio-Rad公司)；化学发光成像分析系统(美国Azure公司)。

1.3 细胞培养与分组 HK-2细胞生长在添加10%胎牛血清的DME/F-12、100.0 U/ml青霉素、0.1 mg/ml链霉素的培养基中，置于37℃、5% CO2培养箱中培养。隔日更换培养基，取对数生长期细胞。将细胞分入4组：正常对照组，用DME/F-12培养液培养细胞24 h；氯化钴诱导缺氧模型组，用含600.0 μM氯化钴[5-6]的培养液培养细胞24 h；单独脂联素处理组，用含2.5 μg/ml脂联素[7-8]的培养液培养细胞24 h；氯化钴+脂联素联合处理组，用600.0 μM氯化钴处理细胞，再加入2.5 μg/ml脂联素联合处理细胞24 h。

1.4 光镜观察细胞形态学变化 HK-2细胞加药处理24 h后，光镜下观察4组细胞的形态学变化。

1.5 活性氧检测 将HK-2细胞接种于培养皿，给予上述4组加药处理24 h后，弃去培养基，PBS清洗3次，每孔加入200 μl终浓度为5 μmol/ L的MitoSOX，37℃避光孵育10 min。再用PBS清洗3次，加入DAPI染色5 min后，PBS清洗3次，用全光谱激光共聚焦显微镜观察各组荧光强度变化并拍照。激发波长为510 nm，发射波长为580 nm，所有样品拍摄参数保持不变。MitoSOX荧光强度反映线粒体超氧化物生成量，即活性氧的表达量。

1.6 流式细胞仪检测 HK-2细胞以每孔1×105个/L接种于六孔板。在37℃、5% CO2的培养箱中加药处理培养24 h后，弃掉培养基，PBS清洗3次。以2 000 r/min离心5 min收集细胞，加入500 μl的Binding Buffer重悬细胞，再加入5 μl磷脂结合蛋白AnnexinV-FITC混匀后，加入5 μl碘化丙啶Propidium lodide混匀，室温避光反应15 min，流式细胞仪检测细胞凋亡。实验重复3次。

1.7 Western Blot检测 取分组后的HK-2细胞，用含有蛋白酶抑制剂混合物的细胞裂解液溶解，收集蛋白上清，BCA蛋白浓度测定法进行定量。将20 μg提取的总蛋白样品用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，再电转印到PVDF膜上，加脱脂牛奶室温封闭2 h后，分别加入一抗IL-1β(1∶1 000)、IL-6(1∶500)、TNF-α(1∶500)及β-tubulin(1∶20 000)，4℃孵育过夜。TBST洗膜3次后加相应二抗37℃下孵育2 h，TBST清洗3次，电化学发光检测。采用Image J图像分析软件分析蛋白条带灰度值。实验重复3次。

2 结果

2.1 4组细胞形态学变化 光镜下，正常对照组细胞呈梭形，胞膜完整，生长良好。氯化钴诱导缺氧模型组细胞形态明显变圆，细胞皱缩，出现细胞碎片，即细胞发生了凋亡和坏死。单独脂联素处理组细胞形态无变化。氯化钴+脂联素联合处理组大部分细胞形态由圆形恢复至梭形，但仍有少量细胞碎片。见图1。

图1 4组细胞形态学变化(200倍)

2.2 4组细胞活性氧检测 正常对照组和单独脂联素处理组的HK-2细胞呈现微弱的红色MitoSOX荧光；氯化钴诱导缺氧模型组的HK-2细胞呈现明亮的红色荧光，而氯化钴+脂联素联合处理组红色荧光的强度明显弱于氯化钴诱导缺氧模型组。见图2。

图2 4组细胞MitoSOX荧光图像(400倍)

2.3 4组细胞凋亡率比较 与正常对照组比较，氯化钴诱导缺氧模型组、氯化钴+脂联素联合处理组的细胞凋亡率均明显上升，差异有统计学意义(P<0.05)。与氯化钴诱导缺氧模型组比较，氯化钴+脂联素联合处理组的细胞凋亡率明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。

图3 4组细胞凋亡率比较

2.4 4组细胞IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表达水平比较 与正常对照组比较，氯化钴诱导缺氧模型组IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表达水平上升，差异有统计学意义(P<0.05)。与氯化钴诱导缺氧模型组比较，氯化钴+脂联素联合处理组IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表达水平下降，差异有统计学意义(P<0.05)。见图4。

图4 4组细胞IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表达水平比较

3 讨论

脂联素在调节能量代谢和炎症反应中起重要作用，且其在多个器官、系统的疾病中发挥关键性的保护效能。本研究结果中,单独脂联素处理组细胞形态无变化；氯化钴诱导缺氧模型组细胞形态明显变圆，细胞皱缩，出现细胞碎片，即细胞发生了凋亡和坏死；氯化钴+脂联素联合处理组大部分细胞形态由圆形恢复至梭形，但仍有少量细胞碎片。这表明，脂联素可以改善氯化钴诱导的HK-2细胞形态变化。

在缺血性肾病的发生过程中，肾组织长期缺血缺氧，导致氧化应激加剧，活性氧增加，过量的活性氧对细胞成分造成损害，引起大量肾细胞凋亡和炎症反应。本研究结果中,正常对照组和单独脂联素处理组的HK-2细胞呈现微弱的红色MitoSOX荧光；氯化钴诱导缺氧模型组的HK-2细胞呈现明亮的红色荧光，而氯化钴+脂联素联合处理组红色荧光的强度明显弱于氯化钴诱导缺氧模型组。这表明，脂联素具有明显的抑制活性氧生成的作用。有研究报道，脂联素发挥肾保护作用与其抑制氧化应激有关[9-10]。Ding等[11]研究发现，活性氧作为一种诱导内质网应激的重要调节因子，在外源性补充脂联素后，产生明显减少。

细胞凋亡与各种器官、系统的发育及疾病病程等均有着密切联系。本研究结果中,与正常对照组比较，氯化钴诱导缺氧模型组、氯化钴+脂联素联合处理组的细胞凋亡率均明显上升，差异有统计学意义(P<0.05)；与氯化钴诱导缺氧模型组比较，氯化钴+脂联素联合处理组的细胞凋亡率明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)。这表明，脂联素具有抑制氯化钴诱导的肾小管上皮细胞凋亡的作用。Cheng等[12]发现，脂联素可通过过氧化物酶体增殖物激活受体α/血红素加氧酶-1依赖通路，作用于肾小管，发挥抑制凋亡的作用，从而保护肾免受缺血再灌注损伤。

除了细胞凋亡，炎症反应也是缺氧损伤后的一种重要病理过程。肾细胞发生缺氧损伤会刺激氧化应激反应，导致活性氧产生，从而引发炎症[1]。IL-1β、IL-6、TNF-α都是公认的炎症因子[13-15]。本研究结果中,与正常对照组比较，氯化钴诱导缺氧模型组IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表达水平上升，差异有统计学意义(P<0.05)；与氯化钴诱导缺氧模型组比较，氯化钴+脂联素联合处理组IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表达水平下降，差异有统计学意义(P<0.05)。这表明，脂联素对氯化钴诱导的肾小管上皮细胞的炎症反应具有抑制作用。有研究报道，在培养的人视网膜色素上皮细胞中，缺氧会导致IL-1β表达增加[16]。而脂联素可以在降低TNF-α、IL-1表达水平的同时减轻胰岛素抵抗[17]。Dikmen等[18]在急性胰腺炎模型中发现，脂联素可以明显抑制TNF-α、IL-1β及IL-6的表达。

综上所述，脂联素可能通过减少活性氧的产生抑制氯化钴诱导的肾小管上皮细胞凋亡及炎症反应。因此，将脂联素作为治疗缺血性肾病的新靶点，可能会为肾内科疾病的临床治疗提供新的思路。