miR-145、miR-146a在慢性阻塞性肺疾病合并冠心病患者血清中的表达及临床意义

赵盼盼，侯梦一

(重庆两江新区第一人民医院医学检验科，重庆 401120)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)在中老年人群中的发病率及病死率居高不下。由于肺功能水平降低、炎症及氧化应激反应增加等因素影响，COPD患者发生心血管疾病的风险明显增加[1]，其中以COPD并发冠心病(coronary artery heart disease，CHD)较为常见。探究COPD并发CHD进展过程中相关因子，对改善患者预后具有重要意义。研究表明，miR-145、miR-146a在COPD患者血清中的表达水平明显降低，且与患者病情严重程度、炎症反应增加有关[2-3]。此外，miR-145被证实可通过靶向调控血管平滑肌细胞，参与胸主动脉夹层发病[4]。而miR-146a作为炎症的负调控因子，其表达下调可通过影响中性粒细胞胞外陷阱生成，影响房颤患者不良心血管事件的发生[5]。因此，本研究通过检测COPD合并CHD患者血清miR-145、miR-146a的表达水平，分析二者在COPD合并CHD发生、发展中的作用及意义。

1 资料与方法

1.1研究对象 收集2014年12月至2019年12月于重庆两江新区第一人民医院就诊的COPD稳定期患者96例，男性54例，女性42例，年龄(65.94±12.86)岁，其中以COPD稳定期合并CHD患者38例作为COPD+CHD组，男性23例，女性15例，年龄(66.27±13.05)岁；以COPD稳定期未合并CHD患者58例作为COPD组，男性31例，女性27例，年龄(65.78±13.24)岁。纳入标准：(1)根据《COPD诊治指南》[6]及WHO中冠心病诊断标准[7]，经冠脉造影检查确诊为COPD或COPD合并CHD；(2)临床资料完整；(3)能够积极配合检查。排除标准：(1)合并其他呼吸系统疾病；(2)合并患有糖尿病、脑血管疾病、肾病、免疫性疾病者；(3)患有严重精神疾病者；(4)肝肾功能严重不足者。另选取同期体检健康者45例作为健康人对照组，男性25例，女性20例，年龄(64.08±12.15)岁。本研究经重庆两江新区第一人民医院医学伦理委员会审核批准(No.1492802)，患者或家属知情同意。

1.2样本采集及一般资料收集 入组患者于入组后第2天清晨空腹采集外周静脉血5 mL(健康人对照组于体检时清晨采集)，4 ℃、1 348.7×g离心15 min后分离上清液，置于-80 ℃保存。采集所有入组者性别、年龄、身体质量指数(body mass index，BMI)、吸烟史等一般资料，收集COPD+CHD组患者资料并进行Gensini评分[8]。

1.3主要仪器及试剂 FX-7000心电图仪(北京福田电子医疗仪器公司)，XE-2100血细胞计数仪、CA-1500全自动凝血仪(日本希森美康公司)，ADVIA 2400全自动生化分析仪、Siemens-Bayer BNP蛋白仪(德国西门子公司)，Genesy 40/50紫外分光光度计(美国赛默飞世尔公司)，7500实时荧光定量PCR(qRT-PCR)仪(美国应用生物系统公司)，Master Screen全自动肺检测功能仪(德国Jager公司)，Cobas B血气分析仪(德国Roche公司)。C反应蛋白(CRP)测定试剂盒(德国凯杰公司)，纤维蛋白原测定试剂盒(武汉纯度生物科技公司)，RNA提取试剂盒(德国Roche公司)，反转录试剂盒(德国凯杰公司)，qRT-PCR试剂盒(日本宝生物公司)。

1.4血常规及生化指标的检测 采用血细胞计数仪及白细胞分类溶血剂、血红蛋白溶血剂、白细胞分类染色液等试剂检测白细胞计数[参考范围：(4.0～10.0)×109/L]、血小板计数[参考范围：(100～300)×109/L]；采用全自动生化分析仪及配套试剂检测高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)(参考范围：0.90～1.90 mmol/L)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein，LDL-C)(参考范围：0～3.4 mmol/L)、三酰甘油(triglyceride，TG)(参考范围：0.56～1.70 mmol/L)、总胆固醇(total cholesterol，TC)(参考范围：2.80～6.50 mmol/L)；采用免疫比浊法，使用BNP蛋白仪及相应试剂检测C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)(参考范围：0～5 mg/L)；采用冯·克劳斯法(Von Clauss法)，使用全自动凝血仪及相应试剂检测纤维蛋白原(参考范围：2～4 g/L)。

1.5qRT-PCR检测血清miR-145、miR-146a表达水平 根据NCBI中miR-145、miR-146a的基因序列(ID：406937和406938)，用Primer Premier 5.0软件进行引物设计，并送北京天根生化科技公司进行引物合成。miR-145上游引物序列：5′-CCTAGCTAGGCGTGGCTCCC-3′，下游引物序列：5′-ACAGCCTAGGCTAAGATACA-3′，产物片段大小173 bp，退火温度为60 ℃；miR-146a上游引物序列：5′-GCAGGCTGGCATGGCTGCCA-3′，下游引物序列：5′-TCTGCAGGCTGGCATGGAAT-3′，产物片段大小186 bp，退火温度为60 ℃；U6上游引物序列：5′-AACGTAACGTGCGGCATCGT-3′，下游引物序列：5′-GCTCCTCTAACGTCAAATGT-3′，产物片段大小218 bp，退火温度为60 ℃。

按照RNA提取试剂盒说明书提取RNA，使用Genesy 40/50紫外分光光度计检测其浓度及纯度，取吸光度(A280/260 nm)值为1.8～2.0的样本进行逆转录反应。按照反转录试剂盒说明书将RNA逆转录为cDNA，样本置于-20 ℃保存。qRT-PCR 反应体系为20 μL，包括：SYBR®Primix Ex TaqTM(2×)10 μL，ROX(50×) 0.4 μL，10 μmol/L上、下游引物各2 μL，50 ng/μL cDNA 2 μL，无酶ddH2O 3.6 μL。循环参数：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，62 ℃ 40 s，73 ℃ 15 s，共40个循环；在60 ℃时收集荧光信号并使用Bio-Rad CFX manager软件进行熔解曲线分析。实验设3个复孔。以U6为内参基因，采用2-△△Ct法计算miR-145、miR-146a相对表达水平，△△Ct=(实验组Ct目的基因-实验组Ct内参基因)-(健康人对照组Ct目的基因-健康人对照组Ct内参基因)。

1.6肺功能及血气指标检测 使用全自动肺检测功能仪检测受试者肺功能指标一秒量(forced expired volume，FEV1)(参考范围：>4.26 L)、用力肺活量(forced vital capacity，FVC)(参考范围：>4.13 L)及一秒率(forced vital capacity rate of one second，FEV1/FVC)(参考范围：>70%)；使用血气分析仪检测受试者血气指标pH(参考范围：7.35～7.45)、动脉血二氧化碳分压(partial pressure of gases from blood gas tension，PaCO2)(参考范围：35～45 mmHg)、血氧分压(partial pressure of oxygen，PaO2)(参考范围：75～100 mmHg)。

2 结果

2.13组一般资料比较结果 健康人对照组、COPD组、COPD+CHD组性别、吸烟比例、年龄、BMI、心率、白细胞计数、血小板计数、HDL-C水平、LDL-C水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)；COPD组、COPD+CHD组患有高血压比例比较，差异无统计学意义(P>0.05)。健康人对照组、COPD组、COPD+CHD组TG、TC、CRP、纤维蛋白原水平依次升高(P<0.05)。见表1。

表1 3组一般资料比较

2.23组血清miR-145、miR-146a的表达水平比较 健康人对照组、COPD组、COPD+CHD组血清miR-145、miR-146a的表达水平均显著降低(P<0.05)，且COPD+CHD组血清miR-145、miR-146a表达水平明显低于COPD组患者(P<0.05)。见表2。

表2 3组血清miR-145、miR-146a表达水平比较

2.33组肺功能、血气指标比较结果 与健康人对照组比较，COPD组、COPD+CHD组肺功能指标FEV1、FEV1/FVC及血气指标pH、PaO2水平均显著降低，血气指标PaCO2水平均显著升高(P<0.05)；COPD+CHD组患者肺功能指标FEV1、FEV1%预计值、FEV1/FVC及血气指标pH、PaO2水平明显低于COPD组，血气指标PaCO2水平明显高于COPD组(P<0.05)。见表3。

表3 3组肺功能指标、血气指标比较

2.4血清miR-145、miR-146a表达水平与临床指标相关性分析 COPD+CHD组患者血清miR-145、miR-146a水平分别与CRP水平、纤维蛋白原水平及Gensini评分呈负相关(P<0.05)，而与肺功能指标FEV1/FVC、血气指标PaO2水平呈正相关(P<0.05)。见表4。

表4 血清miR-145、miR-146a表达水平与临床指标相关性

2.5COPD合并CHD发生危险因素分析 以本研究资料为样本，以COPD合并CHD是否发生为因变量(发生=1，未发生=0)，以表2～4中各组差异有统计学意义的指标/因子为自变量，建立Logistic回归模型。结果如表5所示，高CRP水平、低PaO2水平、低FEV1/FVC水平、高Gensini评分、低miR-145水平、低miR-146a水平是影响COPD并发CHD的独立危险因素(P<0.05)。

表5 COPD合并CHD发生危险因素分析

2.6血清miR-145、miR-146a表达水平对COPD患者并发CHD的诊断价值 以COPD合并CHD患者作为疾病组，COPD组患者作为对照组，当cut-off值为0.61时，血清miR-145水平对COPD患者并发CHD诊断的曲线下面积(AUCROC)为0.753(95%CI:0.654～0.835)，敏感性和特异性分别为60.89%、84.48%；当cut-off值为0.65时，血清miR-146a水平对COPD患者并发CHD诊断的AUCROC为0.717(95%CI:0.616～0.804)，敏感性和特异性分别为63.16%、82.76%。血清miR-145、miR-146a联合诊断COPD合并CHD的AUCROC为0.887(95%CI:0.821～9.520)，明显高于miR-145、miR-146a单独诊断(Z/P值分别为2.280/0.023、2.473/0.012)，且二者联合诊断的敏感性也为最高(89.47%)，但特异性为79.31%，相对二者单独检测时降低。见图1。

图1 血清miR-145、miR-146a表达水平对COPD患者并发CHD的诊断价值的ROC曲线分析

3 讨论

炎症反应和内皮损伤在COPD及CHD发生发展中均起重要作用[4-5]。Dang等[9]在miR-145参与吸烟所致的COPD机制研究中发现，COPD患者肺组织中miR-145表达水平在0～2之间，而未患有COPD者肺组织中miR-145表达水平明显高于COPD患者。本研究中，COPD组血清miR-145表达水平明显低于健康人对照组，与Dang等[9]研究报道的miR-145表达水平相比明显较低，分析原因可能与所选取研究对象不同有关，但也能在一定程度上表明miR-145表达下调可能与COPD发生有关，miR-145下调可能通过靶向调控缺氧诱导的肺动脉平滑肌细胞增殖和迁移，影响气道上皮细胞凋亡和炎症反应增加，参与了COPD进展。急性冠状动脉综合征患者血清中miR-145表达下调预示内皮损伤和炎症反应水平，可作为该疾病潜在的标志物[10]。本研究结果显示，COPD+CHD组血清miR-145表达水平明显低于COPD组患者，提示miR-145可能在调节心肌细胞增殖和心血管疾病进展中发挥重要作用。miR-145低表达可能通过反映血管内皮损伤和炎症反应加重，预示COPD患者并发CHD。

Kivihall等[11]在miR-146与哮喘发病机制关系的研究中指出，哮喘患者支气管灌洗液中miR-146a表达水平低于1，与对照组相比明显降低，且与中性粒细胞计数增加存在相关性(r2=0.149，P=0.035)。本研究结果显示，与健康人对照组相比，COPD组患者血清miR-146a表达水平明显降低，与Kivihall等[11]的结果有所不同但接近一致(均值为0.67 vs 0.36)，分析原因可能为所患疾病不同，但miR-146低表达可能预示COPD发生，与中性粒细胞水平异常引起的炎症反应增加有关。此外，本研究结果显示，与COPD组相比，COPD+CHD组血清miR-146a表达水平明显下调，提示血清miR-146水平下调可能与COPD并发CHD有关。

笔者进一步研究发现，COPD+CHD组血清miR-145、miR-146a水平与CRP、纤维蛋白原水平及Gensini评分呈负相关，而与肺功能指标FEV1/FVC、血气指标PaO2水平呈正相关。以上结果提示miR-145、miR-146a下调可能通过靶向调控转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、CRP等表达，影响平滑肌细胞增殖、迁移及炎症因子表达，促进肺、血管内皮损伤及炎症反应增加，导致COPD患者肺功能损伤及心肌损伤的加重，从而影响COPD进展及并发CHD[5]。

由于本研究阳性样本量较少，故选取表5中与miR-145、miR-146a水平相关的指标/因子为自变量进行Logistic回归分析。结果发现，低miR-145水平、低miR-146a水平是影响COPD并发CHD的独立危险因素，提示miR-145及miR-146a表达可能作为COPD患者并发CHD的生物学标志物。进一步通过ROC曲线分析可知，血清miR-145、miR-146a联合诊断COPD并发CHD的AUCROC为0.887，明显高于miR-145、miR-146a单独诊断，且二者联合诊断的敏感性也最高，表明二者联合对COPD患者并发CHD的诊断价值较高，临床可通过监测二者水平变化对患者病情及预后进行评估。

综上所述，COPD并发CHD患者血清miR-145及miR-146a表达水平下调，且与患者肺功能、血气指标及Gensini评分变化有关，是COPD患者并发CHD的潜在评估指标。但本研究阳性样本量较少，具体作用机制有待进一步深入研究。