雷公藤甲素对IgA肾病大鼠的肾保护作用及对NLRP3炎症小体的影响

周 慧，曲颂扬，田立东

免疫球蛋白A肾病(IgAN)是世界上最常见的肾小球肾炎形式之一，也是终末期肾病的主要原因[1]。25%～30%的IgAN病人需要在20～25年内进行肾脏替代治疗，另外20%～40%的病人在发病后20年内会发生终末期肾病[2-3]。其以血尿和蛋白尿为主要临床表现，病理特征包括肾小球系膜细胞增生并伴有以IgA为主的免疫复合物的沉积[4]。肾移植和透析的成本已成为病人和社会的巨大财务负担[5]。因此，开发用于治疗IgAN的有效药物是十分重要的。雷公藤甲素(triptolide,TR)是中药雷公藤的主要活性成分之一，具有抗炎、抗凋亡及免疫调节等作用[6]，对大鼠肾缺血再灌注损伤、糖尿病肾损伤及慢性肾衰均具有保护作用[7-9]。并且其对于IgAN及系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病的治疗效果也较为突出，但是其具体治疗机制目前尚不明确。NLRP3是近几年发现的重要的炎症复合体之一，其能触发Caspase-1、白细胞介素(IL)-1β和IL-18的成熟以执行炎症反应[10-11]。并且有研究[12-13]已经证实，IL-1β和IL-18是NLRP3炎症小体激活的两个关键标志物，在IgAN病人血清和尿液中表达升高，提示NLRP3炎症小体可能通过调节炎症在IgAN中发挥重要作用。本研究通过建立IgAN大鼠模型，观察雷公藤甲素对IgAN大鼠的治疗作用，并且从NLRP3炎症小体方面探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 SPF级雄性SD大鼠40只，体质量(200±10)g，购于辽宁长生生物有限公司[SCXK(辽)：2012-0001]，动物分笼饲养，室温维持在 20～25 ℃，每日光照12 h。大鼠被随机分为4组：对照组、模型组、雷公藤甲素低剂量组(100 μg/kg)及雷公藤甲素高剂量组(200 μg/kg)，每组10只大鼠。

1.2 药材及试剂 雷公藤甲素标准品购自成都普菲德生物技术有限公司，肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-17A、γ干扰素(IFN-γ)和IL-4 ELISA试剂盒购自上海朗顿生物技术公司，鼠抗β-actin、兔抗IL-1β、 Caspase-1、 IL-18、NLRP3、IgA及β-actin抗体购自Abcam公司，辣根过氧化物酶(HRP)标记兔抗鼠、HRP标记羊抗兔二抗购自北京博奥森有限公司，Cy3标记羊抗兔二抗购自Jackson公司，全蛋白提取试剂盒购自南京凯基生物有限公司，BCA 蛋白定量试剂盒购自碧云天生物有限公司，其他试剂均为国产分析纯试剂。

1.3 仪器 石蜡切片机(德国徕卡公司)，AV5800型全自动生化分析仪(Beckman Coulter公司)，紫外可见分光光度计(上海元析公司)，Nikon荧光倒置显微镜(日本尼康公司)，酶标仪(深圳迈瑞公司)，水平核酸电泳仪、半干式蛋白转膜仪(Bio-Rad)。

1.4 IgAN大鼠模型的建立 按文献[14-15]报道的方法建立IgAN大鼠模型，通过连续8周口服0.1%牛γ-球蛋白(BGG)溶液及连续3 d尾静脉注射1 mg BGG的方法制备IgAN模型。对照组大鼠给予等体积0.9%氯化钠溶液。随后将模型制备成功的大鼠随机分为模型组、雷公藤甲素低剂量(100 μg/kg)及高剂量(200 μg/kg)组，每组10只。各组大鼠连续灌胃给药8周，每天1次，对照组及模型组给予等体积的0.9%氯化钠溶液[16-17]。

1.5 大鼠生化指标检测 将大鼠置于代谢笼内收集24 h尿液，5 000 r/min离心10 min，取上清液检测24 h UTP。末次给药1 h后各组大鼠腹腔注射10%水合氯醛进行麻醉，经腹主动脉采血，10 000 r/min离心10 min分离血清，利用自动生化分析仪检测鼠血清中肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、总蛋白(TP)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)及天门冬氨酸氨基转移酶(AST)含量和尿液中24 h 尿蛋白(24h UTP)水平。

1.6 ELISA检测 ELISA法检测血清中TNF-α、 IL-17A、IFN-γ及 IL-4 水平，按照试剂盒说明书进行操作。加入样品、生物素标记的抗体、链霉亲和素-HRP，37 ℃孵育30 min。加入显色液，37 ℃避光显色30 min，终止显色；以酶标仪在450 nm波长下检测吸光度值，根据不同浓度标准品的OD值绘制标准曲线，得到回归方程，根据回归方程计算样品中TNF-α、IL-17A、 IFN-γ及 IL-4 水平。

1.7 免疫荧光染色 石蜡切片经过二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水，经过高温抗原修复后，1% Triton X-100透化30 min，PBS洗涤；滴加适量5% BSA溶液封闭60 min；滴加兔抗IgA抗体稀释液(1∶500)，4℃孵育过夜，PBS洗涤；滴加Cy3标记的羊抗兔二抗稀释液(1∶500)室温避光孵育1 h，PBS洗涤，倒置荧光显微镜下观察并拍照。

1.8 Western blotting检测 提取各组大鼠肾组织总蛋白，12 000 r/min离心10 min，使用考马斯亮蓝蛋白定量试剂盒对蛋白进行定量分析，100 ℃加热10 min对蛋白进行变性，随后进行SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳，使用PVDF膜转膜，5%脱脂奶粉封闭液封闭，TBST洗膜，分别加入β-actin、兔抗IL-1β、 Caspase-1、IL-18、NLRP3及β-actin一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜，加入相应HRP标记二抗稀释浓度为1∶1 000，室温避光孵育1 h。TBST洗膜，ECL发光试剂盒发光，凝胶成像系统成像，Image J软件计算灰度值，统计分析目的条带与内参蛋白条带光密度的比值。

1.9 统计学方法 采用单因素方差分析和q检验。

2 结果

2.1 雷公藤甲素对IgAN大鼠生化指标及24 h TUP的影响 与对照组相比，模型组血清中Scr、BUN及尿液中24 h TUP含量明显升高(P<0.05～P<0.01)；经不同剂量雷公藤甲素治疗后，血清中Scr、BUN及尿液中24 h TUP含量均明显降低(P<0.05～P<0.01)；但各组大鼠血清中TP、ALT及AST水平无明显变化(P>0.05)(见表1)。

表1 生化指标及24 h UTP含量变化的比较

2.2 雷公藤甲素对IgAN大鼠炎症因子及对肾组织IgA沉积的影响 与对照组相比，模型组IgAN大鼠血清中炎症因子TNF-α、 IL-17A、 IFN-γ和IL-4 水平明显升高(P<0.05～P<0.01)；雷公藤甲素低、高剂量组均能不同程度的降低大鼠血清中TNF-α、 IL-17A、IFN-γ和IL-4 水平(P<0.05～P<0.01)(见表2)。对照组少见IgA免疫球蛋白的沉积，而模型组肾小球IgA免疫球蛋白沉积明显(P<0.01)，雷公藤甲素治疗组IgA免疫球蛋白的沉积情况明显减轻(P<0.01)(见图1)。

表2 肾组织中炎症因子水平的比较

2.3 雷公藤甲素对肾组织IL-1β、Caspase-1、IL-18及NLRP3蛋白的影响 与对照组相比，模型组肾组织中IL-1β、Caspase-1、IL-8及NLRP3蛋白的表达明显升高(P<0.05～P<0.01)；雷公藤甲素治疗后，肾组织中IL-1β、Caspase-1、IL-18及NLRP3蛋白的表达明显降低(P<0.05～P<0.01)(见图2、表3)。

表3 肾组织中IL-1β、Caspase-1、IL-18及NLRP3蛋白的相对表达

3 讨论

IgAN是全球公认的引起肾小球肾炎的最常见的免疫复合物，IgAN的唯一诊断特征是在肾活检中发现肾小球系膜内主要含有聚合IgA的免疫沉积物[18]。IgAN的发病机制目前还不十分明确，大量的临床数据及基础研究均表明，IgAN主要以IgA为主的免疫复合物在肾小球系膜细胞及基质沉积后，通过激活多种细胞因子及信号通路，引发免疫反应过程，导致肾小球硬化、肾小管间质纤维化等，最终造成肾功能衰竭[19]。因此，如何抑制IgA的沉积是缓解IgAN进展、改善预后的关键靶点。

近几年，中医中药在IgAN中的作用逐渐被重视，王骞等[20]利用滋阴凉血汤治疗IgAN大鼠模型，滋阴凉血汤能减少IgA肾病大鼠尿液中红细胞数量、尿蛋白，改善肾小球内系膜基质、细胞增生和肾小管萎缩及炎症反应等病理改变。活血通络清热利湿方能够抑制IgA肾病大鼠肾组织IL-13、IL-4 mRNA的表达及血清循环免疫复合物的分泌，延缓疾病发展，保护肾功能[21]。潘立军等[22]发现补肾调肝化瘀法联合西医基础治疗气阴两虚型IgAN，与单独西医基础治疗相比可更有效减轻中医症候，改善病人临床症状。YANG等[23]发现中药蝉蜕能够通过抑制炎症和细胞凋亡来改善IgAN大鼠的肾脏炎症和纤维化。

中药雷公藤为卫矛科雷公藤属木质藤本植物，主要功效为祛风除湿、活血通络、清热解毒等。雷公藤甲素为其主要药理成分，具有广泛的药理作用，已经证实其具有抗炎、免疫调节、抗肿瘤等作用。研究[24]表明雷公藤甲素能够抑制α平滑肌肌动蛋白、TGF-β1的表达来抑制肾纤维化的进展。雷公藤甲素能有效降低IgAN病人外周血单个核细胞中TNF-α、IL-6、一氧化氮的含量并促进其凋亡，发挥改善作用[25]。但是对于雷公藤甲素改善IgAN的具体作用机制，还未见报道。本研究利用BGG溶液及给予BGG的方法制备IgAN模型，观察雷公藤甲素对IgAN大鼠的保护作用并对其作用机制进行了探讨。

Scr是人体肌肉终产物，BUN是体内的一种含氮化合物，在正常生理状态下，Scr和BUN由肾小球滤过而排出体外，体内Scr和BUN含量处于低水平状态，而在IgAN病人或其他肾功能不全疾病状态下，肾小球滤功能障碍，因此血清中Scr和BUN含量将明显升高[26]。当肾小球功能及泌尿功能受损后，将造成大量蛋白质漏出，导致尿中出现大量蛋白质，因此检测24 h UTP也可反映出肾小球功能是否正常[27]。本研究发现雷公藤甲素治疗后，大鼠血清中Scr、BUN及尿液中24 h UTP水平明显降低，而对TP、ALT及AST水平无影响，说明雷公藤甲素能够改善IgAN大鼠肾小球滤过功能。

近年来，普遍认为IgAN的发生发展与辅助性T淋巴细胞1与辅助性T淋巴细胞2的比例(Th1/Th2)失衡有关。Th1细胞主要分泌IFN-γ、TNF-α等细胞因子，促进B细胞分泌产生可强烈激活补体的IgG亚型，Th2细胞主要分泌IL-4、IL-17等细胞因子，可激活嗜酸性粒细胞，促进B细胞分泌不激活补体的IgG亚型[28]。NAGAKI等[29]发现在自发性产生IgA的小鼠中，幼鼠主要以Th1为主，而随着IgA产生沉积增加，Th2则呈现出优势地位，因此认为IgA的产生可能与Th1/Th2平衡向Th2偏靠有关。有研究[30]证实IFN- γ、TNF-α及IL-4等细胞因子在IgA肾病模型中表达增多，且中晚期IgAN病人的炎症因子表达水平较早期病人高，提示Th1/Th2 分泌的细胞因子参与了IgAN特异的炎症反应和免疫损伤过程，并且炎症因子的水平可以直观反映IgAN的病情。本研究利用ELISA检测各组大鼠血清中TNF-α、 IL-17A、IFN-γ和IL-4的表达，结果显示，雷公藤甲素能够显著降低大鼠血清中TNF-α、 IL-17A、IFN-γ和IL-4水平；同时免疫荧光染色结果发现，雷公藤甲素能够降低大鼠肾组织中IgA的荧光强度，减少IgA的沉积，以上结果说明雷公藤甲素能够通过调节Th1/Th2平衡来抑制肾组织中IgA的沉积，改善肾功能。

NLRP3炎症小体是炎症反应的核心复合物之一，IgA作为NLRP3炎症小体激动剂，可通过线粒体损伤释放活性氧进而激活NLRP3引起炎症级联反应[31]，在动脉粥样硬化、阿尔茨海默病及糖尿病肾病等自身免疫性疾病中发挥重要作用。NLRP3炎症小体主要通过溶酶体破裂方式、半通道方式及活性氧方式激活。活化后的NLRP3炎症小体可招募ASC、Caspase-1形成NLRP3炎症复合体，进而活化Caspase-1，活化后的Caspase-1可以使无活性的IL-1β、IL-18前体加工成为有活性的细胞因子，并分泌到细胞外，参与一系列的炎症反应[31]。有研究[32-34]表明，淫羊藿苷可通过抑制NF-κB介导的NLRP3炎症小体激活来改善IgAN大鼠的肾损伤；白藜芦醇还可以通过保持线粒体完整性和增强自噬来抑制NLRP3炎性体激活，从而改善IgAN大鼠的肾功能。为了探讨雷公藤甲素改善IgAN大鼠的肾功能的机制，我们利用Western blotting检测了肾组织中IL-1β、Caspase-1、IL-18及NLRP3蛋白的表达，结果发现，雷公藤甲素能够显著降低IL-1β、Caspase-1、IL-18及NLRP3蛋白的表达，说明雷公藤甲素改善IgAN大鼠的肾功能可能与抑制NLRP3炎症小体的活化有关。

综上所述，雷公藤甲素改善IgAN大鼠的肾功能、抑制IgA沉积，可能与抑制NLRP3炎症小体的活化有关，为雷公藤甲素用于IgAN临床治疗提供了理论和实验依据。本研究虽初步探讨了雷公藤甲素治疗IgAN大鼠的可能机制，但并未深入利用基因敲除或者抑制剂等手段加以证明，本课题组将在后续的实验中对雷公藤甲素的治疗机制进行深入探讨。