环状RNA在急性髓系白血病中的研究进展

徐秉岐，孔德胜，边思成，李英花

(1.哈尔滨医科大学附属第一医院血液内科，哈尔滨 150001； 2.哈尔滨医科大学附属第四医院血液内科，哈尔滨 150001)

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是最常见的血液系统恶性肿瘤之一，与其他类型的白血病相比，成人AML患者的死亡率居第一位[1]。近年来，针对AML的分子靶向治疗、免疫治疗及造血干细胞移植等均取得了长足进步，但由于复发以及耐药的产生，每年仍有许多患者死于疾病进展[1-2]。因此，深入研究AML发生及发展的分子机制，对寻找新的临床标志物及治疗靶点具有重要意义。随着高通量测序技术的发展，环状RNA(circular RNA，circRNA)被发现广泛分布于真核生物体内并执行复杂的生物学功能[3]。与信使RNA(messenger RNA，mRNA)相比，circRNA更稳定，能在一定程度上耐受RNA酶的降解作用，并具有高度的空间、时序和组织特异性[4]。与其他非编码RNA类似，circRNA在肿瘤的调节过程中发挥重要作用：Chen等[5]基于芯片及二代测序技术，证实circCSNK1G3在前列腺癌细胞的增殖过程中发挥重要作用；Feng等[6]对多发性骨髓瘤小鼠模型的研究发现，hsa_circ_0000190可在骨髓瘤细胞胞质中通过竞争性内源性RNA(competing endogenous RNA，CeRNA)机制结合微RNA(microRNA，miRNA/miR)-767-5p，进而靶向上调促分裂原活化的蛋白激酶4的表达，从而抑制疾病进展；Ping等[7]发现，circ_0009910在AML患者骨髓标本中表达显著上调，并提示不良的预后。现就circRNA的性质、生物学功能及其在AML中的作用予以综述，以期为AML的临床诊治提供新思路。

1 circRNA概述

1.1性质 circRNA以其闭合环状结构为特征，因不具有5′端的帽子结构和3′端的多聚腺苷酸尾结构，故不易被RNA酶识别及降解，从而在生物体内更稳定地存在并发挥作用，显示出极强的稳定性[8]。circRNA亦数量丰富，目前拥有人类全基因组注释信息的circRNA超过14万种，而mRNA仅有3万余种[9]。在某些细胞(如人类成纤维细胞)中，circRNA对应的基因占比达到14%左右[10]。circRNA富集于生物体内的同时，也表现出一定的保守性，Werfel等[11]在3个不同的物种中共发现了9 000余种circRNA，其中1 288 种circRNA在3种物种中均有发现，提示某些circRNA具有一定的进化保守性。此外，随着高分辨率荧光原位杂交、荧光素酶报告基因检测等实验技术的不断优化，circRNA被检测出具有高度组织和发育时序特异性。研究发现，circRNA在神经系统，尤其是树突中含量更高，且在老年人的脑组织中更易聚集[12-13]。Ruan等[14]检测了1 000种人癌细胞系中circRNA的表达情况发现，circRNA在不同的癌细胞中高度特异表达。可见，circRNA兼具稳定性、丰富性、保守性和特异性，这些特殊的性质与其生物学功能具有密切联系，有待学者们进一步探索。

1.2生物学功能 目前，关于circRNA生物学功能的研究主要集中于circRNA对基因表达的调控作用。最初的研究认为，circRNA有两种调控基因表达的机制[3]，其中一种为circRNA通过CeRNA机制调控靶基因的表达。CeRNA机制是指富含miRNA应答元件的RNA，可竞争性地结合并抑制特定的miRNA，解除miRNA对靶基因的抑制作用，富含miRNA应答元件的circRNA可经过circRNA-miRNA-mRNA途径调控靶基因的表达[3]。Yang等[15]发现，circHECW2可通过CeRNA机制竞争性结合miR-30d，上调血管紧张素原5的表达，进而促进上皮-间充质转化，破坏血脑屏障的完整性，提示其在肿瘤细胞的脑转移过程中起重要作用。另一种机制认为，circRNA通过顺式调控作用影响基因转录，如环状内含子RNA可在细胞核中促进RNA聚合酶Ⅱ对锚蛋白重复结构域52亲本基因的转录，进而调控其表达[16]。circRNA不仅能调控基因的表达，早在1986年，就出现了关于circRNA可以表达多肽的文献报道[17]。Yang等[18]发现circFBXW7可以编码一种新的蛋白质FBXW7-185aa，此蛋白可以协同野生型FBXW7蛋白抑制恶性胶质瘤的进展。这些研究不仅了颠覆circRNA、miRNA等非编码RNA不能编码蛋白的传统认知，也提示circRNA在生物体内执行着重要的生物学功能。近年来，外泌体成为circRNA功能研究领域的热点。circRNA在外泌体中高度富集，外泌体直径为40～160 nm，是细胞外囊泡的一部分，可作为细胞间信息交流的重要途径[19-20]。外泌体数据库exoRBase收录了包括健康志愿者、冠心病和结肠癌患者等92份血清外泌体的测序样本，其中包含58 330种circRNA、18 333种mRNA[21]。Zhang等[22]证实，circNRIP1由外泌体分泌后，可以被胃癌细胞吸收并促进癌细胞的增殖、迁移和侵袭。所以，外泌体被认为可以充当circRNA在生物体内的搬运工，并放大其生物学功能。以上研究表明，circRNA在调控基因表达、编码多肽和肿瘤发生及发展的过程中起至关重要的作用。

2 circRNA与急性髓系白血病

研究学者通过高通量测序和芯片技术，已经在各种组织和细胞系中发现了成千上万的circRNA，且经相关体内外实验证实，circRNA在各种良恶性疾病中均发挥重要的生物学功能[5-6,21]。但有关其在AML中的具体功能和分子机制研究较少。目前，已有的circRNA在AML中的研究大致可分为两大类：AML的生物标志物和功能机制研究。

2.1生物标志物

2.1.1诊断标志物 circRNA具有高度的稳定性和特异性，在肿瘤相关的生物标志物领域显示出良好的应用前景。Hirsch等[23]首先发现由核仁磷酸蛋白1环化而成的hsa_circ_0075001与AML存在相关性，从而开启了circRNA作为AML生物标志物的研究。一项关于circRNA的临床研究发现，circVIM在非急性早幼粒细胞白血病患者中表达明显上调，通过绘制受试者工作特征曲线，可显著区分非急性早幼粒细胞白血病和细胞遗传学正常的AML患者，提示circVIM为AML理想的诊断标志物[24]。AML的髓外浸润(extramedullary infiltration，EMI)是指骨髓中的白血病细胞浸润到骨髓以外的任何其他器官和组织，目前没有检测EMI的理想实验室指标[25]。Lv等[26]利用AML患者的骨髓血进行circRNA芯片检测，通过比较EMI和非EMI样本中circRNA的表达差异，筛选出17个与EMI相关的circRNA分子，并对其中的hsa_circRNA_004520进行逆转录聚合酶链反应验证，证实其在EMI中表达上调4.38倍，为寻找AML中EMI的诊断标志物提供了新思路。可见，circRNA的出现，在分子生物学层面丰富了AML的检测手段，从而为AML患者的诊断及治疗提供更有力的科学依据。

2.1.2预后标志物 AML依据形态学和细胞遗传学检查等即可确诊，但能够准确、动态地监测AML疾病进展的生物标志物较少[27]，而早期监测AML的缓解、复发及浸润对AML的预后评估均具有重要意义。Li等[28]应用芯片技术检测circRNA在AML中的表达发现，hsa_circ_0004277在AML患者中表达下调，在复发难治性AML患者中表达进一步下调，提示hsa_circ_0004277可用来监测AML早期复发；且在化疗后获得完全缓解的AML患者中，hsa_circ_0004277表达上调，提示其也可作为评估AML化疗疗效的动态指标。在EMI相关的17个circRNA中，通过结合医学癌症数据库对17个靶基因进行预后分析并绘制生存曲线发现，其中5个靶基因的高表达在AML中提示不良预后[26]。Yi等[24]还发现，高表达circVIM的AML患者的总生存期和无白血病生存期更短。上述研究表明，circRNA在AML中具有生物标志物的价值，但其临床应用仍存在以下问题：①高通量测序及芯片技术价格昂贵，今后可通过完善算法和改进技术降低成本，使得大样本的AML进行circRNA研究成为现实，从而更加全面、系统地评估circRNA在AML中的预后因素。②circRNA不仅仅存在于骨髓中，更在外泌体中大量富集，目前有关AML-外泌体-circRNA的研究处于初始阶段，未来circRNA与AML的研究应尽可能地按AML发病时间轴“初治-缓解-复发/浸润”纳入AML的研究对象，并应在单个研究对象中收集“骨髓血-外周血-外泌体-浸润组织”标本，以助于完善AML患者的预后评价体系。

2.2功能机制

2.2.1细胞增殖与分化 AML的发生和疾病进展与多种调控因素有关，如AML细胞增殖失控、分化障碍等。已有研究发现，circRNA在AML中广泛参与调节上述过程。Fan等[29]发现，circ_100290通过竞争性结合miR-203上调靶基因Rab10的表达，进而抑制凋亡，促进AML细胞增殖。白血病中染色体异位重排形成融合基因的现象十分普遍，Guarnerio等[30]首次发现急性早幼粒细胞白血病和AML的融合基因能产生融合circRNA(fusion-circular RNA，f-circRNA)，f-circRNA在体外实验中可以促进小鼠胚胎成纤维细胞增殖并增强其克隆能力，且这一过程独立于mRNA之外；在体内实验中，f-circRNA可在融合蛋白的协同下，导致健康小鼠进展为白血病。Ping等[7]的研究证实，过表达circ_0009910可以促进白血病细胞增殖，而沉默circ_0009910可以抑制细胞增殖并促进其凋亡。有研究表明，AML与circRNA之间的作用并不是单向的，AML基因组存在双微体基因扩增区域，转录因子p64的双微体扩增可以促进白血病细胞的增殖，同样转录因子p64的双微体扩增也可以引起circRNA的异常表达[31]。circRNA不仅参与调控AML中的细胞增殖过程，Li等[32]通过测序技术得到全反式视黄酸治疗前后508种差异表达的circRNA，提示circRNA在全反式视黄酸诱导急性早幼粒细胞白血病细胞分化过程中具有独立的功能，尤其以circHIPK2对急性早幼粒细胞白血病细胞分化的调节作用最为重要。Sun等[33]基于基因表达数据库分析发现，与无Fms样酪氨酸激酶3基因内部串联重复(Fms-like tyrosine kinase 3-internal tandem duplication，FLT3-ITD)突变相比，FLT3-ITD突变的AML患者circMYBL2的表达水平更高。且该研究进一步证实，circMYBL2通过多聚嘧啶区结合蛋白1提高FLT3蛋白的翻译效率，进而促进AML细胞分化。这些研究不仅揭示了circRNA在AML中调控细胞增殖和分化的作用，也使得开发以circRNA为治疗靶点的药物成为可能。

2.2.2白血病细胞耐药 白血病细胞耐药是AML患者进展为复发难治性AML的重要原因，进而导致化疗方案的失败和极高的死亡率[34-35]。目前，AML化疗耐药的具体分子机制尚不明确，成为相关研究领域的难点。早期研究发现，过表达f-circRNA可增强白血病细胞对化疗药物的耐受性[30]，提示circRNA可参与调控AML的耐药机制。FLT3-ITD突变的AML患者长期预后不佳，目前已开发出针对其突变的抑制剂，研究人员通过敲除circMYBL2，逆转了AML细胞对FLT3-ITD突变抑制剂的耐药，提示circMYBL2适用于FLT3-ITD突变的AML患者的靶向治疗[33]。阿霉素作为AML化疗方案中常见的蒽环类化疗药物，在临床应用过程中表现出较低的化疗敏感性，Shang等[36]通过CeRNA机制揭示了AML中circRNA介导阿霉素耐药的分子机制，与正常人相比，circPAN3在复发难治性AML患者的骨髓样本中表达增加，并能通过竞争性结合miR-153-5p/miR-183-5p，上调X连锁凋亡抑制蛋白的表达，进而增强AML细胞对阿霉素的耐药性。以上研究表明，circRNA在调控白血病细胞耐药的相关领域中具有极大的研究潜力，未来随着circRNA靶向药物的出现，有望提高AML患者的长期生存率。但是AML的疾病进展不仅与细胞增殖、分化和耐药相关，肿瘤免疫、肿瘤微环境和血管新生等病理生理过程在AML中的调控作用也不可忽视，需引起学者们的重视。

3 小 结

目前，AML的常规检查方法包括形态学、细胞遗传学和微小残留病变检测等，近年来二代测序也逐渐用于评价基因突变在AML预后中的意义[27]。在传统化疗的基础上，表观遗传药物(如地西他滨)在复发难治性AML患者中的应用[37]，细胞免疫治疗和造血干细胞移植技术的发展，为AML患者带来了相对丰富和有效的治疗手段。虽然AML的生物标志物和预后评价体系多次进行更新和改进，但仍有许多预后良好的AML患者死亡率较高[38]，接受最新分子靶向治疗的患者仍面临耐药和疾病复发的风险[39-40]，从而导致较短的生存期和较差的生活质量。未来，需扩大样本量及样本类型，在快速发展的生物信息学算法、测序和芯片技术的支持下，寻找出更多具有代表性的circRNA作为生物标志物，以完善对AML乃至整个肿瘤领域的预后评估体系。目前，circRNA在AML致病机制中的研究尚处于起步阶段，且大多数研究均基于circRNA的CeRNA机制，缺乏足够的创新性。随着更多功能机制实验和临床试验的证实，靶向治疗AML的circRNA相关药物必将出现，并广泛实现临床-基础-临床的转化与应用。