ASK1在肾脏相关疾病中的研究进展

汪姝婷，唐金城，李颖，冯江超

(川北医学院附属医院肾内科，四川 南充 637000)

肾脏疾病是临床常见疾病，早期有一定的隐匿性，未经治疗的肾脏疾病大多转化为慢性肾脏病(chronic kidney disease，CKD)。国际肾脏病学会肾脏病数据中心的调查显示，普通人群CKD的患病率为14.3%[1]；而我国横断面研究显示，18岁以上人群CKD的患病率达10.8%[2]。无论何种潜在病因，CKD均会缓慢进展，并导致不可逆的肾单位丢失、终末期肾脏病和(或)过早死亡。导致CKD进展的因素包括实质细胞损失、慢性炎症、纤维化以及肾脏再生能力降低[3]，当前疗法有效性局限且仅能延缓疾病进展，因此迫切需要开发针对肾脏疾病的新疗法和早期识别肾脏损伤的诊断技术以停止或逆转肾脏疾病进展。凋亡信号调节激酶1(apoptosis signal regulated kinase 1，ASK1)具有在生理条件下诱导细胞凋亡的潜力，并通过其他机制在糖尿病、肝脏疾病、癌症、脑卒中、自身免疫性疾病、心血管系统、中枢神经系统疾病中发挥重要作用[4-8]。随着研究的深入发现，ASK1在多种肾脏疾病中有显著作用。现就ASK1在肾脏相关疾病中的研究进展进行综述，旨在为肾脏疾病的临床诊断及治疗提供新思路。

1 ASK1的基本结构与功能

1.1ASK1的基本结构 促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)级联是多种级联中跨物种保守的信号系统，MAPK级联包含三个等级的蛋白激酶：MAPK、促分裂原活化的蛋白激酶激酶(mitogen-activated protein kinase kinase，MAPKK)和促分裂原活化的蛋白激酶激酶激酶(mitogen-activated protein kinase kinase kinase，MAPKKK)。MAPKKK磷酸化并激活MAPKK，然后激活MAPK，活化的MAPK磷酸化多种底物包括转录因子，并调节细胞反应。胞外信号调节激酶、c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)和p38 MAPK是主要的MAPK家族成员[9]。目前有24个已表征的MAPKKK(MAPKKK1～21以及RAF1、BRAF和ARAF)，其中大多数由正常肾脏表达[10]。

ASK1是一种MAPKKK，是一条由约1 000个氨基酸组成的多肽链，激酶结构域及其两端的N端盘管结构域和C端盘管结构域构成其主体[11]。ASK1的N端盘管结构域包含硫氧还蛋白(thioredoxin，TRX)和肿瘤坏死因子受体相关因子(tumor necrosis factor receptor-associated factor，TRAF)的特异性结合区域[12]。在正常生理条件下，ASK1通过与还原形式的TRX结合维持非活性状态[13]。TRAF是一种重要的衔接蛋白，对ASK1下游信号有正向调节作用，在氧化应激情况下与解离的TRX结合发挥作用[14]。目前对于C端盘管结构域的研究尚不深入，其包含的支架蛋白14-3-3可与激酶结构域相互作用并影响其构象变化，其机制类似于TRX[15]。

1.2ASK1的功能及其抑制剂 ASK1蛋白激酶级联通路主要通过响应氧化应激激活钙超载、内质网应激、感染以及受体介导的炎症信号，脂多糖和肿瘤坏死因子等也可诱导ASK1信号转导[16]。TRX激活后从N端解离形成ASK1信号体，同时苏氨酸残基磷酸化，下游底物MAPKK被激活，随后MAPK激活，包括JNK家族的MAPKK4/MAPKK1途径和p38 MAPKK3/MAPKK6途径[17]。以上通路被激活后可诱导细胞凋亡、促进炎症反应及纤维化信号转导[18]。在肾脏中，此通路可调节与肾脏疾病相关的关键过程，如细胞存活、死亡、分化和增殖[19]，JNK和p38 MAPK的激活在肾脏浸润细胞和固有细胞中尤为明显，包括足细胞、肾小球系膜细胞、肾小管上皮细胞和成纤维细胞[20-23]。肾小球中p38的激活与局灶节段性增生性病变相关，而间质中p38的激活与间质炎症和纤维化相关[23]。肾小管间质区JNK信号通路与巨噬细胞浸润、间质纤维化和肾功能不全相关[21-22]。

研究发现，ASK1缺陷型(ASK1-/-)小鼠可正常发育并维持正常的生理功能，表明ASK1信号通路只促进病理过程而不影响稳态功能[24]。在病理条件下，除肾脏疾病外，ASK1还参与心血管疾病、神经退行性疾病以及肝脏相关疾病的发生[25]。

2 ASK1与肾脏疾病发病机制

2.1ASK1与肾脏疾病中的氧化应激状态 氧化应激是急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)过渡到CKD和CKD基础上诱发AKI的重要危险因素[26]。在急性或慢性肾损伤期间，氧化应激产生的自由基和促氧化剂可能会进一步加快疾病进程，并在随后并发症的发生发展中发挥作用[27]。ASK1可因活性氧类(reactive oxygen species，ROS)的解离、缔合而受到动态调控，特别是以ROS依赖性方式与ASK1结合的分子在调节ASK1活性中起重要作用[28]，ROS诱导的氧化应激、异常蛋白质聚集诱导的内质网应激等最终均被整合到ASK1中，从而启动JNK/p38激酶信号通路，进一步导致细胞死亡[29]。被刺激的ASK1信号体形成分子量明显增加的复合物，其中包含ASK1的各种调节因子(TRAF2、TRAF6、蛋白磷酸酶5和泛素特异性蛋白酶9X)以响应ROS，衔接蛋白TRAF2和TRAF6被募集到ASK1信号体中，通过促进N端盘管结构域的同源相互作用正向调节ASK1的活性[13]。蛋白磷酸酶5以ROS依赖性方式使ASK1的活性磷酸化位点去磷酸化，并负向调节ASK1的活性[30]。此外，泛素特异性蛋白酶9X可通过去泛素化和稳定ASK1正调节ASK1活性[31]。

2.2ASK1与肾脏纤维化 肾纤维化是CKD发展到终末期肾脏病的常见病理过程。肾纤维化的细胞基础包括肌成纤维细胞活化、细胞外基质成分过量产生以及炎症细胞浸润[32]。肾活组织检查发现，在各类纤维化肾脏疾病患者中，ASK1下游信号通路p38和JNK活化水平在肾小球和肾小管间质中增加[20]。JNK信号转导促进肾小管上皮细胞炎症及纤维化病程，并促使间质表型的肾小管细胞去分化，JNK途径还与其他促纤维化途径相互作用，如JNK可以直接磷酸化信号转导蛋白同源物3，以增强促纤维化分子的转录[33]，但目前JNK在肾成纤维细胞中的作用机制尚不清楚。

ASK1抑制剂在抗肝纤维化中显示出良好的效果[34]。ASK1-/-肾纤维化小鼠中p38活化程度明显降低，且肾脏中肾胶原(羟脯氨酸)含量也显著减少[35]。ASK1通路在纤维化过程中起重要作用，ASK1抑制剂可阻止肾纤维化进展，甚至诱导纤维化消退。

3 ASK1与AKI

3.1ASK1与新月体肾炎 新月体肾小球肾炎又称快速进展性肾小球肾炎，有超过50%的肾小球发生毛细血管外增殖，可迅速发展为晚期肾病综合征[36]。ASK1抑制剂可通过减少人新月体肾小球肾炎中p38 MAPK/JNK的活化延缓肾损伤进展。在肾毒素血清导致的新月体肾病大鼠模型中，ASK1抑制剂处理后p38和JNK活化显著降低，肾组织中新月体的形成及蛋白尿减少，巨噬细胞活化及T细胞浸润度降低，肾纤维化改善[37]。抗基膜性肾炎属于Ⅰ型新月体肾小球肾炎，通过对抗基膜性肾炎小鼠进行研究发现，五肽化合物PLNPK(Pro-Leu-Asn-Pro-Lys)也可通过抑制大鼠肾小球系膜细胞中p38 MAPK的磷酸化抑制肾小球系膜细胞活化,减少肾小球内巨噬细胞聚集，从而减轻肾组织的损伤程度[38]。可见，ASK1抑制剂可能在新月体肾小球肾炎中具有治疗潜力。

3.2ASK1与肾缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury，IRI) IRI是指器官经历短暂的血流供应减少或停止后重新建立灌注时触发的炎症损伤。在临床环境中，IRI会导致严重的AKI，发病率和病死率均较高[39]。缺血再灌注期间肾组织损伤由膜脂质过氧化、蛋白质和DNA的氧化损伤导致。研究发现，抗氧化剂防御机制的增强对肾组织有保护作用[40]，其保护作用可能通过抑制ASK1信号通路完成。Wang等[41]的研究发现，提前给予抗氧化剂亚硒酸盐的小鼠肾脏缺血3 h后ASK1、p38的磷酸化显著减少，从而保护肾小管上皮细胞免受IRI诱导的细胞凋亡损伤。

Terada等[42]发现，IRI后ASK1-/-小鼠JNK和p38 MAPK的磷酸化减少，凋亡细胞及浸润的白细胞数量减少，血尿素氮和血清肌酐水平明显低于ASK1表型正常的小鼠，而ASK1表型正常小鼠肾脏组织学表现出更大程度的肾小管坏死和降解。以上结果表明，ASK1在IRI诱导的AKI中被激活，而ASK1阻滞可减弱肾小管凋亡及肾功能损伤。此外，国内利用蛋白酪氨酸磷酸酶1失活突变小鼠构建肾IRI模型的研究发现，蛋白酪氨酸磷酸酶1通过作用于ASK1实现对肾IRI的保护作用[43]。综上，抑制ASK1可对抗肾IRI，其保护作用可能通过抑制细胞凋亡和氧化应激实现。

3.3ASK1与造影剂肾病(contrast-induced nephropathy，CIN) CIN指给予对比剂48～72 h内出现的肾功能损害(血清肌酐较基线值增加25%或绝对血清肌酐增加0.005 g/L)，目前已成为医院获得性AKI的主要原因。CIN的病理机制复杂，包括肾内血管收缩导致髓质缺氧、ROS的产生以及直接的肾小管毒性[44-45]。有学者推测，CIN相关的ASK1途径活化可能由ROS产生而诱发，新型N-乙酰半胱氨酸酰胺可通过抗氧化活性和上调TRX1有效抑制ASK1途径的活化，从而保护肾功能[46]。体外实验也表明，用ASK1下游底物抑制剂(JNK抑制剂、p38抑制剂)预处理肾细胞可明显减弱造影剂诱导的肾细胞凋亡[47]。

可见，造影剂诱发的氧化应激反应可以激活ASK1信号转导通路，从而造成肾损伤，故抑制ASK1信号通路可能是CIN的治疗靶点，但目前尚无ASK1抑制剂在CIN中发挥作用的直接证据，需要进行大规模动物实验和随机临床试验，以确定抑制ASK1预防CIN的有效性，从而早期识别、正确调整用药剂量并及时对高危患者进行干预。

4 ASK1与CKD

糖尿病肾脏病(diabetic kidney disease，DKD)是一种糖尿病微血管并发症相关的CKD，也是肾功能衰竭的主要原因[48]。氧化应激、晚期糖基化终末产物形成、细胞信号转导和更新以及纤维化等是DKD病理生理的关键[49]。DKD患者体内的ASK1一旦被炎症和氧化应激激活会导致肾纤维化并促进DKD进程[50]。内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)功能障碍与人类DKD有关，eNOS缺陷型(eNOS-/-)小鼠对肾脏损害的敏感性增强，其与遗传性肥胖的瘦素受体缺陷型(db/db)小鼠杂交后代(db/db eNOS-/-)可强有力地模拟2型DKD[45]。每日给予ASK1抑制剂GS-444217治疗可减少db/db eNOS-/-小鼠的肾小球瘢痕形成、足细胞死亡和肾纤维化，防止肾小球滤过改变和蛋白尿形成[45]。Tesch等[50]在链脲佐菌素注射诱发的糖尿病小鼠的研究发现，GS-444217治疗可减少促炎分子信使RNA及肾小管损伤标志物肾损伤分子-1的表达。研究还显示，早期和晚期干预对糖尿病小鼠的病情均有益[50]。证明GS-444217在DKD中有较大的治疗窗口，为预防DKD进展提供了新的治疗策略。

肾纤维化是CKD的典型标志。单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction，UUO)是构建进行性肾小管间质纤维化的方法。手术后第7天，与野生型小鼠相比，ASK1-/-UUO小鼠肾小管细胞凋亡、间质巨噬细胞蓄积和间质纤维化程度明显降低，可能与p38 MAPK和JNK激活减少有关[35]。另外，UUO手术前1 h开始服用GS-444217，亦可阻止p38 MAPK活化，并使JNK活化程度降低60%，且肾组织的纤维化及肾小管细胞凋亡情况与ASK1-/-小鼠相似[18]。以上研究表明，UUO模型中GS-444217提供的肾保护作用与ASK1缺乏症的影响非常相似。肾切除术模拟的CKD是基于肾单位不足和高血压原理的手术模型。Liles等[18]采用此种模型进行研究发现，GS-444217干预可防止蛋白尿进一步增加，并减缓肾小球硬化进展，而联用依那普利可进一步抑制蛋白尿并显著降低肾小球硬化程度，这一发现为在CKD的治疗中使用ASK1抑制剂作为血管紧张素转换酶抑制剂的辅助疗法提供了支持。由此可见，ASK1抑制剂和ASK1缺陷均通过阻断CKD小鼠体内ASK1信号通路发挥作用，这为阻止CKD进展、延长CKD患者生命带来希望。

5 ASK1与心肾综合征

心肾综合征(cardiorenal syndrome，CRS)是由一个器官的功能障碍导致另一器官急性或慢性功能障碍，病变涉及心脏、肾脏和血管系统等，CRS的发病率和病死率高，且病理机制复杂，涉及神经激素、炎症过程、氧化应激和代谢紊乱间的相互作用[51-52]。抑制ASK1可能有助于减轻CRS，延缓疾病发作。据报道，ASK1可促进与年龄相关的心血管疾病中的氧化应激和炎症反应，而其下游信号通路p38 MAPK的过度激活是心脏和肾脏疾病的共同特征[53-54]。

尿毒症毒素的累积是肾排泄功能受损的标志，且尿毒症毒素的心脏毒性是CRS的驱动因素[55]。透析患者尿毒症毒素硫酸吲哚酚硫酸盐和对甲酚硫酸盐水平明显升高，并能够与白蛋白结合，从而形成无法通过透析膜孔的大蛋白复合物[56-57]。有研究显示，ASK1抑制剂可减轻由硫酸吲哚酚硫酸盐和对甲酚硫酸盐引起的心脏肥大和心肾纤维化，认为ASK1抑制剂可能有助于延缓尿毒症毒素介导的CRS进展[58]。

组胺可能是通过靶向ASK1/MAPK信号通路，改善CRS大鼠的心肾功能并减轻心脏和肾脏的纤维化。在冠状动脉左前降支结扎结合5/6次全肾切除术诱发的2型CRS大鼠模型中，组胺可明显抑制CRS大鼠心脏和肾组织中磷酸化的ASK1和MAPK，并降低血清肌酐、血尿素氮和脑利钠肽水平，改善左心室重构和收缩功能[59]。

6 ASK1抑制剂在肾脏疾病中的治疗潜力

ASK1抑制剂在多发性硬化症、接触性超敏反应、肿瘤生长、对乙酰氨基酚肝毒性等动物模型中具有治疗作用[25]，近来其在部分肾病模型及临床试验中也显示出治疗潜力。GS-444217是一种口服ATP竞争性ASK1抑制剂，对ASK1具有高度选择性[18]，被应用于多种肾脏疾病的临床前研究。GS-44217处理可预防eNOS-/-糖尿病小鼠肾脏p38 MAPK的活化，早期(2～8周)干预可减少肾小球硬化和肾功能丢失，而晚期(8～5周)干预可阻止肾小球硬化发展、肾脏炎症和肾小管损伤，并改善肾功能[50]。GS-44217治疗效果与p38 MAPK或JNK抑制剂的治疗效果相当，但无p38 MAPK和JNK抑制剂相关的不良反应[18,37]。另一种ASK1抑制剂NQDI-1也表现出良好疗效，提前给予NQDI-1的肾缺血大鼠可避免肾脏氧化应激、肾小管细胞凋亡、肾功能丧失和组织学损害[60]，表明使用ASK1抑制剂进行预防性治疗可保护肾脏免受 IRI。

以上研究为药物研发提供了依据。2016年，吉利德公司评估了选择性ASK1抑制剂塞洛塞替尼对2型糖尿病和难治性中度至重度DKD的安全性和有效性，表明塞洛塞替尼可减慢DKD的进展，但由于未预期的混杂因素(如塞洛塞替尼介导的肌酐分泌抑制)，该试验未达到终点[61]。目前正在进行塞洛塞替尼的Ⅲ期临床试验，以评估其在延缓DKD肾功能下降、降低肾功能衰竭风险或全因死亡率方面的确切疗效。

ASK1抑制剂可能有助于肾脏疾病治疗，但ASK1抑制剂会抑制p38 MAPK和JNK的激活，因此需要谨慎看待其可能产生的副作用。一项针对结肠炎模型的研究表明，Ask1-/-小鼠骨髓巨噬细胞对引起结肠炎的细菌的灭活能力降低，导致肠道炎症的发生率增加[62]。因此需要对使用ASK1抑制剂的研究对象进行持续观察，以评估远期安全性和有效性。

7 展 望

ASK1在多种肾脏疾病模型中表现出显著的保护作用；此外，ASK1作为肾脏疾病的新靶点还具有一定的预测性，其基线水平升高在肾脏疾病患者出现蛋白尿或肾功能下降前就已经表现出来，可能成为未来研究的重点。但目前ASK1在肾脏疾病中的研究较为局限，未来需要扩展ASK1在其他类型肾脏疾病中的作用，如感染引起的肾脏疾病(肾盂肾炎等)以及自身免疫性疾病引起的肾脏疾病(狼疮性肾炎等)，从而为肾脏疾病的早期诊断、预后评估以及靶向治疗提供新思路。