MEBO 对糖尿病溃疡大鼠创面组织中MMP-9、MMP-2、 TIMP-1、 TIMP-2 动态表达的影响

李杰辉 卢 维 刘雪琴 陈壮丽

糖尿病溃疡是糖尿病的严重并发症之一, 具有高截肢率和高死亡率等特点［1］。 研究数据显示, 糖尿病足的发病率高达19% ～34%［2］, 其中20%的患者可最终发展至截肢, 而截肢患者的死亡率又高达22%［3-4］, 因此, 给予糖尿病溃疡患者科学有效的治疗具有重要意义。 目前, 糖尿病溃疡的难愈机制尚不完全明确, 近年来部分研究学者指出糖尿病患者晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products, AGEs) 异常蓄积及炎症反应紊乱与糖尿病溃疡的发生及发展密切相关, 且基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMP) 与基质金属蛋白酶抑制剂 (tissue inhibitors of metalloproteinase,TIMP) 的动态平衡在糖尿病溃疡创面的修复中发挥了重要作用［5-7］。 湿润烧伤膏 (moist exposed burn ointment, MEBO) 为内含黄芩、 黄柏、 黄连等成分的纯中药制剂, 在诸类慢性难愈合创面的治疗中取得了较为显著的临床疗效, 且其促创面愈合作用机制的相关研究也日渐深入［8-9］, 但其与MMP-9、 MMP-2、 TIMP-1、 TIMP-2 的相关性研究却鲜见报道。 鉴于此, 笔者于本研究中观察了糖尿病溃疡大鼠创面组织中MMP-9、 MMP-2、 TIMP-1、TIMP-2 的动态表达水平, 并深入探讨了MEBO 对其表达水平的影响。

1 实验材料

1.1 实验动物

健康SPF 级雄性SD 大鼠160 只, 12 周龄, 体质量(200 ±20) g, 广西医科大学实验动物中心提供, 许可证号SCXK (桂) 2009-0002。 将大鼠单笼适应性饲养于温度20 ～25 ℃、 相对湿度(60 ±10)%的环境中, 2 周后用于实验研究。 本研究经广西壮族自治区中医药研究院实验动物伦理委员会批准。

1.2 主要试剂与设备

MEBO： 汕头市美宝制药有限公司生产, 批号1902403G； 重组牛碱性成纤维细胞生长因子(recombinant bovine basic fibroblast growth factor,rb-bFGF) 外用溶液： 珠海亿胜生物制药有限公司生产, 批号04191007； 链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)： 美国Sigma 公司生产, 批号WXBC8740V；MiniBEST Universal RNA Extraction Kit、 Prime-ScriptTMRT Master Mix (Perfect Real Time)、 TB Green®Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)： 日本TaKaRa 公司生产； 引物设计及合成： 宝生物工程(大连) 有限公司完成； 超微量核酸蛋白测定仪(型号NanoDrop)： 美国Thermo Fisher 公司生产； 实时荧光定量PCR 仪(型号LightCycler 480Ⅱ)： 瑞士Roche 公司生产； 高速冷冻离心机(型号HC-3018R)： 安徽中科中佳科学仪器有限公司生产； 美迪信血糖仪及配套血糖试纸： 天津亿朋医疗器械有限公司生产。

2 方法

2.1 模型制备与分组

随机选取120 只大鼠用高脂高糖饲料(60.4%基础饲料+10.0%猪油+8.0%蛋黄粉+1.5%胆固醇+20.0%蔗糖+0.1%胆酸钠) 喂养4 周后禁食不禁水12 h, 并予以STZ (40 mg/kg) 腹腔注射,制备糖尿病大鼠模型(剪尾法采血, 血糖仪测定随机血糖≥16.7 mmol/L, 且体重明显下降, 病理组织学检查结果显示胰岛细胞被破坏, 即视为糖尿病大鼠模型制备成功［10］)； 继而正常进食进水喂养4周后, 共97 只大鼠糖尿病模型维持良好, 剔除血糖＞29.5 mmol/L、 体重＞340 g 的大鼠后, 随机选取90 只大鼠并随机分为模型组、 MEBO 组与bFGF组, 每组30 只, 同时随机选取未予特殊处理的30只大鼠作为空白组。 各组大鼠均腹腔注射3.5%水合氯醛(10 mL/kg) 麻醉后, 腹卧位固定, 背部剃毛, 于脊柱正中肩胛骨下缘水平线下2.0 cm 处做直径1.8 cm 深达筋膜层的全层皮肤缺损创面。

2.2 创面处理

空白组与模型组大鼠创面依次覆盖2 层凡士林油纱及无菌干纱布包扎固定, MEBO 组大鼠创面依次覆盖2 层MEBO 药纱(药物含量约0.2 g/cm2)及无菌干纱布包扎固定, bFGF 组大鼠创面依次覆盖2 层重组牛碱性成纤维细胞生长因子(recombinant bovine basic fibroblast growth factor, rb-bFGF)药纱(药物含量约60 U/cm2) 及无菌干纱布包扎固定, 每天换药1 次, 连续处理12 d。

2.3 观察创面愈合情况

分别于药物干预第4、 6、 12 天, 每组随机选取10 只大鼠测量创面面积, 计算创面愈合率。 创面愈合率＝ (创面初始面积-时相点创面面积) /创面初始面积×100%。

2.4 qRT-PCR 法检测创面组织中MMP-9、 MMP-2、TIMP-1 及TIMP-2 mRNA 水平

分别于药物干预第4、 6、 12 天, 每组随机选取10 只大鼠麻醉后采集相同位点创面组织置于液氮中冷冻保存。 待所有标本收集完毕后, 取出液氮中冻存的创面组织, 根据试剂盒说明书采用Trizol法提取总RNA, 并在10 μL 反转录体系中反转录合成cDNA 后进行PCR 扩增, 以GAPDH 作为内参基因, 实验结果分析Ct 值, 采用2-△△Ct法计算mRNA相对表达量。 MMP-9 引物序列为F： 5′-CCAGAGC GTTACTCGCTTGGA-3′, R： 5′-CTTAGTTCAAGGGC ACTGCAGGA-3′； MMP-2 引物序列为F： 5′-TCCCG AGATC TGCAAGCAAG-3′, R： 5′-AGAATGTGGCC ACCAGCAAG-3′； TIMP-1 引物序列为F： 5′-CATCT C TGGCCTCTG GCATC-3′, R： 5′-CATAACGCTGGT ATAAGGTGGTCTC-3′； TIMP-2 引物序列为F： 5′-GACACGCTTAGCATCACCCAGA-3′, R： 5′-CTGTGA CCCAG TCCATCCAGAG-3′； GAPDH 引物序列为F：5′-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3′, R： 5′-ATG GTGGTGAAGACGCCAGTA-3′。

2.5 酶联免疫吸附法检测创面组织中胶原蛋白水平

分别于药物干预第4、 6、 12 天, 每组随机选取10 只大鼠麻醉后采集相同位点创面组织, 常规予以组织脱水、 石蜡包埋、 切片、 脱蜡, 并进行Masson 复合染色后予以脱水、 透明、 封片； 100 倍显微镜下随机选择5 个视野, 采用Image Proplus 图像分析软件进行图像分析, 测量并计算胶原蛋白水平。 胶原蛋白水平＝胶原蛋白面积/总面积×100%［11］。

2.6 统计学处理

采用SPSS 22.0 统计软件对所得数据进行统计学分析, 结果数据符合正态分布以均数± 标准差表示, 多组间比较采用单因素方差分析,两组间比较采用q 检验, 均以P ＜0.05 为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 各组大鼠创面愈合率对比

干预第4、 6、 12 天, 模型组大鼠创面愈合率均明显低于其他各组(P 均＜0.05), 空白组大鼠创面愈合率均明显高于其他各组(P 均＜0.05),而MEBO 组与bFGF 组间无明显差异 (P 均＞0.05), 详见表1。

3.2 各组大鼠创面组织中MMP-9、 MMP-2、 TIMP-1及TIMP-2 mRNA 表达水平对比

干预第4、 6、 12 天, 模型组大鼠创面组织中MMP-9 及MMP-2 mRNA 表达水平均明显高于其他各组(P 均＜0.05), TIMP-1 及TIMP-2 mRNA 表达水平均明显低于其他各组(P 均＜0.05)； 除干预第6 天MEBO 组大鼠创面组织中TIMP-1 mRNA表达水平明显高于bFGF 组(P ＜0.05) 外, 其余各时间点MEBO 组与bFGF 组大鼠创面组织中MMP-9、 MMP-2、 TIMP-1 及TIMP-2 mRNA 表达水平均无明显差异(P 均＞0.05), 详见表2。

表1 各组大鼠创面愈合率对比Table 1 Comparison of wound healing rate amongthe four groups

表1 各组大鼠创面愈合率对比Table 1 Comparison of wound healing rate amongthe four groups

注： MEBO 为湿润烧伤膏, bFGF 为碱性成纤维细胞生长因子；空白组与模型组采用凡士林油纱换药处理, MEBO 组采用MEBO 药纱换药处理, bFGF 组采用rb-bFGF 药纱换药处理。 各组大鼠创面愈合率组间两两对比, 其中与空白组对比, aP ＜0.05, 差异具有统计学意义； 与模型组对比, bP ＜0.05, 差异具有统计学意义Note： MEBO stands for Moist Exposed Burn Ointment, bFGF stands for basic fibroblast growth factor； dressing change with Vaseline gauze was performed on rats in the blank group and model group, dressing change with MEBO gauze in the MEBO group,and dressing change with rb-bFGF gauze in the bFGF group.Pairwise comparison of the wound healing rate of rats was made among the four groups,among which comparison with the blank group showed statistically significant difference (aP ＜0.05), and comparison with the model group showed statistically significant difference(bP ＜0.05)

表2 各组大鼠创面组织中MMP-9、 MMP-2、 TIMP-1 及TIMP-2 mRNA 表达水平对比Table 2 Comparison of mRNA expression levels of MMP-9， MMP-2， TIMP-1 and TIMP-2 in the wound tissue of rats among the four groups

注： MEBO 为湿润烧伤膏, bFGF 为重组牛碱性成纤维细胞生长因子, MMP-9 为基质金属蛋白酶-9, MMP-2 为基质金属蛋白酶-2,TIMP-1为基质金属蛋白酶抑制剂-1, TIMP-2 为基质金属蛋白酶抑制剂-2； 空白组与模型组采用凡士林油纱换药处理, MEBO 组采用MEBO 药纱换药处理, bFGF 组采用rb-bFGF 药纱换药处理。 各组大鼠创面组织中MMP-9、 MMP-2、 TIMP-1 及TIMP-2 mRNA 表达水平组间两两对比,其中与空白组对比, aP ＜0.05, 差异具有统计学意义； 与模型组对比, bP ＜0.05, 差异具有统计学意义； 与MEBO 组对比, cP ＜0.05, 差异具有统计学意义Note： MEBO stands for Moist Exposed Burn Ointment, bFGF stands for basic fibroblast growth factor, MMP-9 stands for matrix metalloproteinase-9,MMP-2 stands for matrix metalloproteinase-2, TIMP-1 stands for tissue inhibitor of metalloproteinase-1, and TIMP-2 stands for tissue inhibitor of metalloproteinase-2； dressing change with Vaseline gauze was performed on rats in the blank group and model group,dressing change with MEBO gauze in the MEBO group, and dressing change with rb-bFGF gauze in the bFGF group.Pairwise comparison of mRNA expression levels of MMP-9, MMP-2,TIMP-1 and TIMP-2 in the wound tissues of rats was performed among the four groups, of which comparison with the blank group showed statistically significant difference (aP ＜0.05),comparison with the model group showed statistically significant difference (bP ＜0.05), and also comparison with the MEBO group showed statistically significant difference (cP ＜0.05)

组别Group只数Number of rats MMP-9 mRNA MMP-2 mRNA TIMP-1 mRNA TIMP-2 mRNA第4 天Day 4第6 天Day 6第12 天Day 12第4 天Day 4第6 天Day 6第12 天Day 12第4 天Day 4第6 天Day 6第12 天Day 12第4 天Day 4第6 天Day 6第12 天Day 12 Blank group 10 1.00 ±0.31空白组1.00 ±0.33 1.00 ±0.05 1.00 ±0.33 1.00 ±0.36 1.00 ±0.05 1.00 ±0.19 1.00 ±0.15 1.00 ±0.23 1.00 ±0.24 1.00 ±0.21 1.00 ±0.23 Model group 10 1.87 ±0.36a 0.39 ±0.16a MEBO 组模型组9.61 ±1.93a 8.65 ±0.78a 4.86 ±1.15a 6.02 ±1.56a 2.61 ±0.29a 0.14 ±0.02a 0.41 ±0.09a 0.39 ±0.16a 0.21 ±0.04a 0.36 ±0.05a MEBO group 10 1.43 ±0.17ab 0.70 ±0.04ab bFGF 组5.90 ±0.53ab 1.88 ±0.17ab 3.56 ±0.69ab 2.22 ±0.65ab 1.10 ±0.32b 0.33 ±0.07ab 0.89 ±0.17b 0.71 ±0.06ab 0.40 ±0.07ab 0.51 ±0.08ab bFGF group 10 1.44 ±0.40ab 0.66 ±0.05ab F 值F value 12.170 93.190 381.320 35.330 44.270 42.400 141.800 19.270 36.630 70.240 58.640 33.800 6.05 ±1.12ab 2.11 ±0.64ab 3.50 ±1.02ab 2.19 ±1.15b 1.33 ±0.58b 0.27 ±0.02ab 0.52 ±0.32abc 0.69 ±0.05ab 0.36 ±0.07ab 0.46 ±0.08ab P 值P value ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

3.3 各组大鼠创面组织中胶原蛋白水平对比

干预第4、 6、 12 天, 模型组大鼠创面组织中胶原蛋白水平明显低于其他各组(P 均＜0.05)；除干预第4 天MEBO 组大鼠创面组织中胶原蛋白水平明显高于bFGF 组(P ＜0.05) 外, 其余各时间点MEBO 组与bFGF 组大鼠创面组织中胶原蛋白水平均无明显差异(P 均＞0.05), 详见表3、 图1。

表3 各组大鼠创面组织中胶原蛋白水平对比Table 3 Comparison of collagen levels in wound tissues of rats among the four groups

表3 各组大鼠创面组织中胶原蛋白水平对比Table 3 Comparison of collagen levels in wound tissues of rats among the four groups

注： MEBO 为湿润烧伤膏, bFGF 为碱性成纤维细胞生长因子；空白组与模型组采用凡士林油纱换药处理, MEBO 组采用MEBO 药纱换药处理, bFGF 组采用rb-bFGF 药纱换药处理。 各组大鼠创面组织中胶原蛋白水平组间两两对比, 其中与空白组对比, aP ＜0.05, 差异具有统计学意义； 与模型组对比, bP ＜0.05, 差异具有统计学意义； 与MEBO 组对比, cP ＜0.05, 差异具有统计学意义Note： MEBO stands for Moist Exposed Burn Ointment, bFGF stands for basic fibroblast growth factor；dressing change with Vaseline gauze was performed on rats in the blank group and model group, dressing change with MEBO gauze in the MEBO group,and dressing change with rb-bFGF gauze in the bFGF group.Pairwise comparison of the collagen level in the wound tissues of rats was made among the four groups, of which comparison with the blank group showed statistically significant difference (aP ＜0.05), comparison with the model group showed statistically significant difference ( bP ＜0.05), and comparison with the MEBO group also showed statistically significant difference (cP ＜0.05)

组别Group只数Number of rats第4 天Day 4第6 天Day 6第12 天Day 12空白组Blank group 10 37.00 ±2.98 44.88 ±2.30 61.88 ±2.36模型组Model group 10 16.88 ±1.36a 23.38 ±2.20a 36.38 ±2.14a MEBO 组MEBO group 10 29.25 ±2.55ab 38.50 ±2.39ab 61.25 ±2.12b bFGF 组bFGF group 10 25.00 ±1.60abc 35.88 ±2.95ab 59.00 ±2.62ab F 值F value 142.500 132.500 278.100 P 值P value ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

4 讨论

创面修复是多因素、 多细胞共同参与的复杂过程, 包括炎症期、 增殖期、 组织重塑期及其相互重叠的多个修复阶段, 涉及成纤维细胞、 内皮细胞、角质形成细胞及炎性细胞等多种细胞以及细胞外基质(extracellular matrix, ECM) 蛋白降解等多个环节。 近年来部分研究显示, MMP 及TIMP 可参与调节ECM 的合成与降解平衡［12］。 MMP 是zn2+依赖性内肽酶, 可通过参与ECM 的降解而影响创面组织的修复、 重塑及瘢痕形成； TIMP 是MMP 内源性抑制剂, 可通过与MMP 催化区进行可逆性结合而抑制MMP 的活性［13］。 因此, 部分研究学者推测MMP/TIMP 失衡可能是糖尿病溃疡创面延迟愈合的重要机制之一［14-15］。

MMP-2 又称明胶酶A, 主要由成纤维细胞、 内皮细胞分泌产生； MMP-9 又称明胶酶B, 主要由白细胞和角质细胞分泌产生, 两者均可通过降解ECM 中的Ⅳ、 Ⅴ、 Ⅹ型等胶原及基底膜成分参与创面修复中角质细胞与基底膜的分离、 细胞迁移及基质重塑等环节。 TIMP-1 是MMP-9 的特异性抑制剂, 能够与MMP-9 前体及活性MMP-9 形成非共价复合物, 特异性抑制MMP-9 的活性。 TIMP-2 是MMP-2 的内源性特异性抑制因子, 能够通过抑制MMP-2 的表达调节ECM 的正常代谢。 正常创伤状态下, TIMP-1、 TIMP-2 会随着MMP-9、 MMP-2 的表达水平而动态变化, 以维持ECM 的降解平衡［16］。 部分研究显示, 糖尿病溃疡患者创面组织中MMP-9、 MMP-2 活性 显著 增 强, 而TIMP-1、TIMP-2 表达水平相对缺乏, 不足以抑制MMP-9、MMP-2 的活性, MMP/TIMP 的动态平衡被打破,从而使蛋白过度水解, ECM 降解持续增强, 导致创面迁延难愈［17-18］。 本研究结果亦显示, 创面损伤第4 天, 糖尿病溃疡大鼠创面组织中MMP-9、MMP-2 mRNA 表达水平均显著高于空白组, 而TIMP-1、 TIMP-2 mRNA 表达水平均显著低于空白组, 两者比例明显失衡, 且创面组织中胶原蛋白水平的显著降低也再次证实了MMP/TIMP 失衡理论。

相关研究显示, MEBO 作为一种纯中药制剂,主要通过液化排除创面坏死组织、 再生创面各层组织等作用在糖尿病溃疡等创面的修复中取得了较为满意的临床疗效［19-20］。 本研究笔者为进一步探究MEBO 促进糖尿病溃疡创面愈合的作用机制, 研究分析了MEBO 对糖尿病溃疡大鼠创面组织中MMP-9、MMP-2、 TIMP-1 及TIMP-2 mRNA 表达水平的影响,并将已证实具有调节MMP/TIMP 平衡作用的rb-bFGF作为了阳性对照。 结果显示, 干预第4、 6、 12 天,MEBO 组与bFGF 组大鼠创面组织中MMP-9 及MMP-2 mRNA 表达水平均明显低于模型组, TIMP-1、TIMP-2 mRNA 与胶原蛋白水平以及创面愈合率均明显高于模型组, 且MEBO 组与bFGF 组间无明显差异。 可见, MEBO 能够显著降低糖尿病溃疡大鼠创面组织中MMP-9、 MMP-2 mRNA 表达水平, 提升TIMP-1、 TIMP-2 mRNA 表达水平, 增加胶原蛋白含量, 进而促进创面愈合。

图1 干预第4、 6、 12 天, 各组大鼠创面组织中胶原蛋白Masson 染色图( ×100)Fig.1 Masson staining of collagen in wound tissues of rats in each group on day 4,6 and 12 of treatment ( ×100)

综上所述, MEBO 可显著降低糖尿病溃疡大鼠创面组织中MMP-9、 MMP-2 mRNA 表达水平, 提升TIMP-1、 TIMP-2 mRNA 表达水平, 增加胶原蛋白含量, 调节MMP/TIMP 平衡可能是其促进糖尿病溃疡创面愈合的作用靶点, 但其是否对MMP/TIMP 系统中的其他类型基因蛋白具有干预作用有待进一步深入研究探讨。