KIM-1 及NGAL 在苯酚烧伤致大鼠早期肾损伤中的表达水平及意义

滕力群 廖 欣 李 卫

苯酚(化学式为C6H5OH) 属于弱酸酚类有机物, 又称石炭酸, 广泛应用于化工及医药领域,但其又是一种细胞原浆毒物, 除可导致皮肤烧伤外, 还可经呼吸道、 消化道及完整皮肤吸收入血引发全身中毒［1-2］。 临床研究显示, 苯酚烧伤患者除皮肤烧伤外, 尤以肾损伤最为突出, 特别是苯酚烧伤面积在25% TBSA 以上者烧伤早期即可出现严重肾功能损害, 一旦控制不及时, 病死率极高［3-4］。 故有研究学者主张, 即使患者血肌酐(Serum creatinine, Scr) 正常也应及早给予苯酚烧伤患者血液透析治疗, 以预防肾损伤［5］。 然而, 血液透析治疗可引发失衡综合征、 电解质紊乱、 心律失常等并发症, 进而加重烧伤患者休克风险。 因此, 及早判断苯酚烧伤患者肾损伤情况至关重要。

目前, 苯酚烧伤所致急性肾损伤的诊断主要依据Scr 水平和尿量变化进行判断, 但Scr 水平可受年龄、 性别、 饮食、 运动等多种因素影响, 尿量变化可受尿路梗阻、 血容量状态等因素限制。 另外,血酚含量检测有助于评估病情和指导治疗, 但该检测方法因受仪器设备等限制未得到应用, 因此探寻更为特异、 敏感的肾损伤标志物迫在眉睫。 近年来, 肾损伤分子-1 (kidney injury molecule-1, KIM-1)和中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白 (neutrophil gelatinase-associated lipocalin, NGAL) 因在肾损伤患者中呈现高表达状态, 被越来越多的研究学者关注。 为进一步分析其临床应用价值, 为苯酚烧伤患者的诊疗提供参考, 笔者于本研究中动态观察了苯酚烧伤所致急性肾损伤大鼠血清KIM-1、 NGAL 水平的变化情况, 分析了血清KIM-1、 NGAL 对苯酚烧伤后肾损伤的早期诊断价值。

1 材料与方法

1.1 实验动物

4 周龄健康SPF 级SD 雄性大鼠48 只, 体重(320 ±18) g, 均购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司, 并饲养于清洁级动物实验室内, 室温控制在20 ～25 ℃, 相对湿度控制在40% ～60%, 每天给予12 h 光照。 本研究经复旦大学附属金山医院实验动物伦理委员会批准。

1.2 主要实验药物及设备

苯酚： 国药集团化学试剂有限公司, 批号20190214； 水合氯醛： 生工生物工程(上海) 股份有限公司, 批号20181224； 大鼠KIM-1 试剂盒(批号5DEQFB3301)、 大鼠NGAL 试剂盒(批号AR6BHB8901)： 美国Immunoway 公司； Scr 试剂盒： 南京建成生物工程研究所, 批号20190325；BOX998 多功能酶标仪： 美国Bio Tek 公司； Multifuge X1 台式离心机： 美国Thermo Fisher Scientific公司； BH-2 显微镜： 日本Olympus 公司。

1.3 模型建立及分组

将48 只SD 大鼠按体重编号后, 采用SPSS 软件(种子数20190421) 将其随机分为对照组6 只、实验组42 只, 继而再将实验组随机分为7 个亚组,每组6 只, 分别用于烧伤后15、 45 min 以及2、 4、8、 16、 32 h 的检测。 对照组大鼠仅于10%水合氯醛(0.3 mL/100 g) 腹腔注射麻醉后, 做背部脱毛处理； 实验组大鼠于背部脱毛处理后予以90%苯酚灼伤2 min, 制作面积为5% TBSA 的苯酚烧伤模型(所有大鼠烧伤模型均制作成功)。

1.4 组织病理学检查及KIM-1、 NGAL、 Scr 水平检测

分别于烧伤后15、 45 min 以及2、 4、 8、 16、32 h 取相应小组大鼠于10%水合氯醛(0.3 mL/100 g) 腹腔注射麻醉后进行解剖, 取肾脏组织,依次行石蜡包埋、 切片、 苏木精-伊红(hematoxylineosin, HE) 染色后, 显微镜下观察组织病理变化；采集腹主动脉血液静置1 h 后, 3500 r/min 离心10 min, 分离上层血清, 严格按照试剂盒说明书采用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 检测KIM-1、 NGAL 水平, 采用肌氨酸氧化酶法检测Scr 水平。

1.5 统计学处理

采用SPSS 25.0 统计软件对所得数据进行统计学分析, 符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示, 多组间比较采用单因素方差分析；KIM-1、 NGAL 水平与肾损伤的相关性分析采用Spearman 相关性分析； KIM-1、 NGAL、 Scr 水平对肾损伤的诊断价值采用受试者工作特征曲线(receiver operator characteristic curve, ROC) 进行分析, 并进一步采用MedCalc 19.1 软件比较各组P值, R-3.5.3 软件计算净重分类改善度(net reclassification improvement, NRI) 和综合区分改善度(integrated discrimination improvement, IDI)； 均以P ＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 苯酚烧伤后大鼠临床表现

苯酚烧伤2 min 内大鼠出现全身抽搐及肌束颤动, 随着时间的延长大鼠皮肤逐渐由浅红色变为棕红色, 创面边界清晰, 质地稍韧, 无水疱形成及表皮脱落(图1), 并伴有肉眼血尿。

图1 苯酚烧伤后15 min, 大鼠皮肤呈浅红色伴少许棕红色Fig.1 At 15 min postburn,the rat skin was light red with a little brown red in color

2.2 苯酚烧伤后大鼠肾脏病理组织学变化

苯酚烧伤32 h 内, 大鼠肾脏组织逐渐出现肾小管空泡样变性、 蛋白质管型、 肾小管扩张及肾小管上皮细胞核固缩坏死(图2 -5)。

2.3 各组大鼠KIM-1、 NGAL 及Scr 水平对比

大鼠烧伤后32 h 内, 血清KIM-1、 NGAL 水平均呈先升高后降低的趋势, 其中KIM-1 水平于烧伤后15 min 开始升高, 8 h 到达高峰； NGAL 水平于烧伤后2 h 开始升高, 16 h 到达高峰； 而Scr 水平升高不明显, 详见表1。

图2 对照组大鼠肾脏组织HE 染色图( ×400)； 图3 苯酚烧伤后16 h 实验组大鼠肾脏组织HE 染色图见肾小管出现空泡样变性( ×400)Fig.2 HE staining results of rat renal tissues in the control group ( ×400)； Fig.3 HE staining showed vacuolar degeneration of renal tubules in rat renal tissues at 16 h postburn in the experiment group ( ×400)

图4 苯酚烧伤后16 h 实验组大鼠肾脏组织HE 染色图见肾小管管腔内出现蛋白质管型及肾小管扩张( ×400)； 图5 苯酚烧伤后16 h 实验组大鼠肾脏组织HE 染色图见肾小管管腔内出现肾小管上皮细胞坏死( ×400)Fig.4 HE staining showed protein cast of renal tubules and tubular dilation in rat renal tissues at 16 h postburn in the experiment group ( ×400)； Fig.5 HE staining showed epidermal cell necrosis in rat renal tubules at 16 h postburn in the experiment group ( ×400)

表1 各组大鼠血清KIM-1、 NGAL、 Scr 水平对比Table 1 Comparison of serum KIM-1， NGAL and Scr among all groups

表1 各组大鼠血清KIM-1、 NGAL、 Scr 水平对比Table 1 Comparison of serum KIM-1， NGAL and Scr among all groups

注： KIM-1 为肾损伤分子-1, NGAL 为中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白, Scr 为血肌酐； 与对照组对比, aP ＜0.05； 与15 min 组对比,bP ＜0.05； 与45 min 组对比, cP ＜0.05； 与2 h 组对比, dP ＜0.05； 与4 h 组对比, eP ＜0.05； 与8 h 组对比, fP ＜0.05； 与16 h 组对比,gP ＜0.05Note： KIM-1 is kidney injury molecule-1, NGAL is neutrophil gelatinase-associated lipocalin, Scr is serum creatinine.aP ＜0.05 as compared with the control group； bP ＜0.05 as compared with the 15 min group； cP ＜0.05 as compared with the 45 min group； dP ＜0.05 as compared with the 2 h group； eP ＜0.05 as compared with the 4 h group； fP ＜0.05 as compared with the 8 h group； gP ＜0.05 as compared with the 16 h group

组别Group只数Number of rats KIM-1 (pg/mL) NGAL (pg/mL) Scr (μmol/L)对照组Control group 6 12.91 ±2.53 1788.32 ±101.38 49.83 ±7.76 15 min 组15 min group 6 30.47 ±3.93a 1755.49 ±180.05 53.00 ±5.55 45 min 组45 min group 6 34.10 ±2.21ab 1688.86 ±177.08 62.00 ±8.53ab 2 h 组2 h group 6 41.11 ±4.40abc 2620.85 ±163.87abc 53.17 ±9.20 4 h 组4 h group 6 38.00 ±2.88abc 2683.57 ±140.34abc 60.17 ±9.74a 8 h 组8 h group 6 63.16 ±2.74abcde 3448.33 ±167.48abcde 58.50 ±5.82 16 h 组16 h group 6 38.81 ±1.98abcf 3858.43 ±331.59abcdef 53.67 ±7.34 32 h 组32 h group 6 30.21 ±3.04acdefg 3120.57 ±94.72abcdefg 54.17 ±6.85 F 值F value 125.723 122.510 1.749 P 值P value ＜0.001 ＜0.001 0.125

2.4 KIM-1、 NGAL 水平与早期肾损伤的相关性分析

Spearman 相关性分析结果显示, KIM-1、NGAL 水平与早期肾损伤具有显著相关性 (r ＝0.664、 0.730, P 均＜0.001)。

2.5 KIM-1、 NGAL、 Scr 水平对早期肾损伤的诊断价值

以病理组织学检查结果中出现“肾小管坏死”作为金标准, 绘制KIM-1、 NGAL、 Scr 的ROC 曲线。 结果显示, 烧伤32 h 内大鼠血清KIM-1、NGAL 联合检测对诊断早期肾损伤具有显著优势(表2 -4、 图6)。

表2 血清KIM-1、 NGAL、 Scr 水平在大鼠早期肾损伤中的诊断价值Table 2 Values of serum KIM-1， NGAL and Scr in diagnosing early renal injury of rats

表3 血清KIM-1、 NGAL、 Scr 诊断大鼠早期肾损伤的AUC 对比Table 3 Comparison of AUC of serum KIM-1， NGAL and Scr in diagnosing early renal injury of rats

表4 血清KIM-1、 NGAL、 Scr 诊断大鼠早期肾损伤的NRI、 IDI 对比Table 4 Comparison of NRI and IDI of serum KIM-1，NGAL and Scr in diagnosing early renal injury of rats

图6 血清KIM-1、 NGAL、 Scr 水平在大鼠早期肾损伤诊断中的ROC 曲线Fig.6 ROC curve of serum KIM-1, NGAL and Scr levels in diagnosing early renal injury of rats

3 讨论

苯酚作为一种重要的化工原料, 目前其市场已进入高速发展期, 与此同时其在生产、 储存、 应用过程中因泄漏而导致的皮肤烧伤发病率也随之上升［6］。 苯酚可造成全身多器官功能受损, 其中肾损伤是苯酚烧伤患者最为突出的并发症之一, 可明显增加患者的病死率, 因此给予苯酚烧伤患者科学有效的肾损伤防控对提高患者预后具有重要意义［5］。然而, 目前对苯酚烧伤患者肾损伤的诊疗均无统一标准。

KIM-1 是一种Ⅰ型跨膜糖蛋白, 属于免疫球蛋白超家族中的一员。 相关动物实验研究证实,KIM-1在正常肾组织中几乎不表达, 但在缺血性或中毒性肾损伤的近曲小管上皮细胞内却呈高表达状态［7］。 生理状态下, NGAL 在肝、 肾、 肺、 胃和结肠中表达水平极低, 但当各脏器组织上皮细胞受损时其表达量明显升高, 特别是在缺血性或中毒性肾损伤的肾小管升支粗段能大量分泌入血, 且由于近端肾小管重吸收功能降低, 其在尿液中的水平也随之上升［8］。 本实验参考既往的实验研究［9-10］, 最终确定建立烧伤模型的烧伤面积为5%、 作用时间为2 min, 所有大鼠皮肤均成功建立Ⅱ度烧伤创面且无大鼠死亡。 实验中大鼠皮肤在苯酚烧伤后逐渐出现较明显的肾脏病理组织学改变, 且相较于Scr,血清KIM-1 及NGAL 水平变化较早且较明显, 与肾损伤存在显著相关性。 进一步经ROC 曲线分析发现, 苯酚烧伤32 h 内, 血清KIM-1、 NGAL 水平对诊断肾损伤具有较高的敏感度与特异度, 且两者间无明显差异, 特别是两者联合检测对诊断肾损伤具有重要意义。 NRI 和IDI 是近年新兴起的风险评估指标, 与AUC 相比, 能够提供更多的增量信息［11］。 本实验通过分析NRI 和IDI 发现, 相较于Scr, KIM-1 和NGAL 对苯酚烧伤所致大鼠早期肾损伤的诊断效能有改善趋势, 且NGAL 及两者联合诊断的IDI 结果更显著, 与AUC 对比的结果相一致。可见, KIM-1、 NGAL 有助于提高肾损伤早期诊断的敏感性和特异性。 KIM-1 可通过p38 丝裂原活化蛋白激酶信号通路促进生长因子产生而参与肾小管上皮细胞的去分化和增殖过程［12］； NGAL 可通过铁离子的转运参与调节铁敏感基因而诱导肾小管上皮细胞的转化, 且可通过清除氧自由基参与肾损伤的修复［13］, 这可能是两者在肾损伤大鼠中高表达的主要原因。 另外, 基于本研究中血清KIM-1、NGAL 表达水平及病理表现的变化情况, 猜测苯酚通过皮肤吸收后经肾脏代谢时直接损伤肾小管上皮细胞导致其滤过屏障受损, 同时因红细胞碎片、 血红蛋白沉淀堵塞造成缺血、 缺氧等进一步加重肾损伤, 甚至导致急性肾功能衰竭可能是苯酚烧伤所致肾损伤的主要发病机制, 值得进一步深入研究探讨。

综上所述, 血清KIM-1 及NGAL 能够较早反应苯酚烧伤后的肾功能变化, 与肾损伤程度密切相关, 对早期诊断肾损伤具有较高的敏感度和特异度, 可为临床上苯酚烧伤患者早期肾损伤的防治提供依据。