Notch信号通路介导的自噬改变在多囊卵巢综合征中的作用及机制研究*

任楠楠，周 珊，刘红莉△

(1.西安市人民医院检验科 710004;2.西北妇女儿童医院生殖妇科，西安 710039)

多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)是一种女性常见的生殖内分泌疾病，能够引起卵巢内颗粒细胞和卵泡细胞发育障碍，导致不孕和不良妊娠的结局[1-2]。研究表明，PCOS影响着5%～10%的育龄女性。PCOS主要临床表现为肥胖、血脂异常及胰岛素抵抗(IR)等。目前针对PCOS病理机制的研究较多，主要认为与基因的改变相关，例如一些合成激素分泌相关的基因、炎性因子、脂代谢相关基因及自噬相关基因等[3]。卵巢中的细胞反应可能是PCOS的最初病理机制，进而引起下丘脑-垂体-卵巢轴(hypothalamus-pituitary-ovary axis，HPO)紊乱，激素水平出现异常导致临床症状的产生。自噬是细胞发生的不同于凋亡的程序性死亡，过度的自噬对细胞来说无疑是一种损伤[4]。目前研究发现，卵巢中的颗粒细胞若发生过度自噬，则可能导致PCOS的发生。Beclin1蛋白分子是自噬发生的关键分子，是自噬泡形成的重要组成部分。Beclin1分子表达的水平能够间接反映细胞自噬的状态。调控自噬发生的信号通路较多，mTOR是最经典的一条通路，mTOR对自噬的发生能够起到负面的调控作用[5]。然而对于mTOR上游调控的机制仍未阐明，深入研究PCOS过程中卵巢细胞Notch信号通路的改变，观察Notch信号通路与mTOR相关分子的关系，阐明Notch信号通路对自噬表达水平的影响，将会为PCOS的防治提供理论依据和分子靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

SD大鼠(购自空军军医大学动物实验中心)；来曲唑(江苏恒瑞医药)；HE染色试剂(武汉谷歌生物公司)；戊巴比妥钠(北京化工厂)；Jagged1(美国Sigma公司)；噻唑蓝(MTT)、RMPI-1640培养基(美国Sigma公司)；Actin、Beclin 1、mTOR、p70s6k、LC3、Hes1和Notch 1抗体(英国Abcam公司)；二甲亚砜(DMSO，美国Gibco公司)。

1.2 方法

1.2.1SD大鼠POCS模型的建立

运用MALIQUEO等[6]的方法，用来曲唑200 μg/d灌胃的方式建立PCOS大鼠模型。将体质量约为200 g的SPF级雌性SD大鼠40只，分为对照组、来曲唑干预组(200 μg/d)、Jagged1处理组、来曲唑+Jagged1处理组。SD大鼠每天保持光照12 h，环境温度控制在20～24 ℃，湿度范围是60%±5%，自由进食和饮水。

1.2.2血清样本及卵巢组织的采集

实验各组SD大鼠末次灌胃给药后禁食过夜，次日称量各组SD大鼠体质量，用2%戊巴比妥钠麻醉后，剥离胸腔，暴露心脏，从心房抽取静脉血，室温放置30 min，2 500 r/min离心15 min，取上清液分装冻存在-80 ℃冰箱中备用。抽取静脉血后，在SD大鼠腰椎背侧用75%乙醇消毒，双侧分别做一1 cm左右的切口，取出SD大鼠的双侧卵巢。一侧用4%多聚甲醛固定，另一侧放于离心管中存入-80 ℃冰箱。

1.2.3激素水平的测定

通过化学发光法对各组SD大鼠血清中的雌二醇(E2)、促卵泡生长激素(FSH)、促黄体生成素(LH)进行检测。具体方法按照试剂盒说明书进行，每组各设两个复孔，保证结果相对偏差在±15%范围内，变异系数小于15%。

1.2.4卵巢HE染色

将在10%甲醛溶液中浸泡24 h以上的卵巢组织，常规石蜡包埋进行组织切片，厚度为3～4 μm，行HE染色：(1)二甲苯脱蜡；(2)乙醇水化；(3)苏木精染色；(4)1%盐酸乙醇分化，自来水冲洗10～20 s；(5)伊红染色；(6)脱水，透明，封片。

1.2.5Hela 细胞培养及MTT检测

Hela细胞常规37℃、5%的CO2、饱和湿度孵箱培养。细胞分为4组：空白对照组、白头翁皂苷B4处理组(20 mg/mL)、Jagged1处理组、Jagged1+白头翁皂苷B4处理组(20 mg/mL)。细胞接种在96孔板中，待细胞完全贴壁处于良好状态下每孔加入20 μL浓度是5 mg/mL的MTT溶液，继续放入细胞培养箱孵育4 h，用移液器分别吸去各孔中的上清液，每孔加入150 μL DMSO，运用酶标仪检测各孔的吸光度值，计算细胞活力。

1.2.6Western blot 检测自噬相关蛋白和信号通路

将4组处理的Hela细分别运用蛋白提取试剂盒提取蛋白样品，运用紫外分光光度计进行蛋白浓度定量，蛋白浓度配平后放入-80 ℃冰箱保存。进行凝胶电泳(恒流条件下实施电压80 V，电泳时间为120 min)，电转(恒压条件下实施电流250 mA，电转时间为90 min)。4 ℃一抗(β-actin、Beclin 1、LC3、Hes1、Notch 1)孵育16 h，二抗室温孵育2 h，用ECL发光法显色。各组以β-actin蛋白作为内参。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 PCOS大鼠模型的建立

与对照组相比，PCOS模型组SD大鼠体质量显著升高(P<0.05)，见图1A；PCOS组与对照组相比血清中E2、FSH水平显著降低(P<0.05)，见图1B；对照组卵巢呈现大量黄体形态结构，存在不同发育阶段的卵泡：例如窦状卵泡、排卵前卵泡。卵泡颗粒细胞层排列紧密，形态结构正常。PCOS模型组卵巢则显现为病理性的改变，黄体结构较少，并且发现卵泡大量扩张，颗粒细胞层排列稀疏，没有放射冠及卵母细胞存在，存在卵巢间质细胞增生，卵巢呈典型多囊样变性病变，见图1C。

A：PCOS建模过程中各组体质量的改变；B：各组血清中雌二醇及促卵泡生长素的改变；C：HE染色检测各组形态学改变；*:P<0.05。

2.2 PCOS能够诱导自噬的发生

Western blot检测显示PCOS模型组与对照组相比自噬相关蛋白LC3和Beclin1表达水平显著升高(P<0.05)，见图2A。RT-PCR检测显示PCOS模型组与对照组相比自噬相关蛋白LC3和Beclin1表达水平显著升高(P<0.05)，见图2B。

**:P<0.01。

2.3 PCOS能够抑制Notch信号通路的活化

Western blot检测发现PCOS模型组与对照组相比，Notch1、Hes1蛋白处于抑制状态，见图3。

**:P<0.01。

2.4 激活Notch信号通路能够降低自噬的发生，进而抑制PCOS的病理发生

Jagged1干预能够引起Notch信号通路激活，与来曲唑共同处理后发现，来曲唑处理组的自噬相关蛋白表达降低，自噬发生可能受到抑制，同时，Jagged1+白头翁皂苷B4处理组，细胞活力与单纯白头翁皂苷B4处理组增加，见图4。

A：对照组;b:来曲唑干预组;c:Jagged1干预组;d:来曲唑+Jagged1干预组;*:P<0.05;**:P<0.01。

3 讨 论

PCOS是当今影响育龄女性不孕不育的主要疾病，并对机体的内分泌存在一定的影响。其发病机制尚未阐明，本研究首先检测了PCOS模型建立的是否成功，运用目前对于PCOS模型检测的几个指标进行观察：血清中E2、FSH表达水平及卵巢组织的形态学观察[7]。发现PCOS模型组与对照组相比血清中E2、FSH水平显著降低，形态学检测也发现卵巢病理性的改变：黄体结构较少，并且发现卵泡大量扩张，颗粒细胞层排列稀疏，没有放射冠及卵母细胞存在，存在卵巢间质细胞增生，卵巢呈典型多囊样变性病变。诸多的结果表明本研究PCOS模型建立成功。自噬是细胞内的一种生理活动，在细胞各种应激过程中均会表达异常，有研究指出自噬与许多疾病的发生存在着紧密的联系[8]。为了进一步揭示PCOS的发病机制，本研究检测了PCOS卵巢组织中自噬水平的表达情况，Beclin1和LC3分别是自噬发生过程中的关键蛋白分子，两种蛋白水平的改变可以代表细胞自噬的水平[9]。Western blot检测提示PCOS模型组自噬相关蛋白LC3、Beclin1表达水平增高。研究表明，自噬属于细胞的第二程序性死亡，参与细胞多项生理活动，且自噬的发生可能与PCOS关系密切[10-11]。本研究也发现PCOS模型组自噬水平上调，提示自噬的异常表现可能是导致PCOS的病理机制之一。调控自噬发生的信号通路较多，其中最为经典的为mTOR/p70s6k信号通路[12]。本研究为揭示PCOS模型中引起自噬水平升高的分子机制，运用Western blot检测了mTOR/p70s6k信号通路的活化状态，提示PCOS抑制了mTOR/p70s6k信号通路。PCOS很可能是通过mTOR/p70s6k信号通路调节自噬发生的。Notch信号通路与mTOR关系紧密，且参与细胞的免疫、应激、生长、分化及细胞增殖等各项生命活动[13-15]。本研究检测了Notch信号通路相关分子的改变情况，结果提示PCOS能够抑制Notch信号通路上的相关分子Notch1，Hes1，Notch信号通路可能参与了PCOS的病理发生过程。为了进一步验证Notch信号通路在PCOS发病过程中的分子机制和作用，运用Notch信号通路的一种激活剂Jagged1在PCOS建模过程中进行干预，观察Notch信号通路激活后自噬水平和PCOS病理进程的改变。结果发现经过Notch激动剂的干预，PCOS模型建立的过程中病理进程有所缓解，血清中E2、FSH水平与模型组相比有所升高，提示Notch信号通路活化能够改善PCOS的发生。用Western blot检测了Notch信号通路活化后，mTOR/p70s6k信号通路的改变，结果提示，mTOR/p70s6k信号通路与模型组相比处于活化状态。本研究检测了自噬相关蛋白Beclin1和LC3的水平，经过Notch信号通路激活剂干预后，卵巢组织中自噬相关蛋白表达受到抑制。验证了Notch信号通路对自噬具有一定的调控作用，且激活Notch信号通路改善PCOS的发生很可能是通过调控自噬来完成的。

本研究证实了自噬的发生在PCOS发生中的重要作用，进一步揭示了mTOR/p70s6k信号通路及Notch信号通路的改变，阐明了Notch信号通路对自噬的调控作用在PCOS发生过程中的重要意义。为临床上PCOS的治疗和预防提供了重要的分子靶点和理论依据。