NOD1和NOD2在Hp阳性胃癌发生、发展中的作用机制研究

申学东,王红卫,呼延智伟

(1.武警第一机动总队医院门诊部,河北定州 073000;2.山西省晋中市第一人民医院消化科 030600)

当前世界范围内胃癌发病率不断升高，相关死亡病例已居恶性肿瘤的第2位，有数据显示我国恶性肿瘤死亡患者中约1/4为胃癌患者[1]。胃癌的危险因素包括幽门螺杆菌(Hp)感染、高盐摄入、吸烟、饮酒和宿主遗传易感性等，据估计有65%的胃癌与Hp感染有关[2]。先天免疫系统作为人体抵抗Hp感染的第一道防线，其抵抗力强弱与Hp感染的临床结局直接相关。核苷酸结合寡聚化结构域(NOD)1和NOD2蛋白可通过核因子-κB(NF-κB)通路诱导天冬氨酸蛋白水解酶-3(caspase-3)活化，促进细胞凋亡，在免疫系统抵御Hp感染过程中发挥着重要作用[3]。因此，本研究分析NOD1和NOD2在Hp阳性胃癌发生、发展中的作用机制，为临床诊疗提供帮助。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2016年1月至2019年6月于山西省晋中市第一人民医院行手术治疗的124例胃癌患者标本，患者均经病理检查诊断明确，其中男67例，女57例，年龄27～74岁。根据13C呼气试验和快速尿素酶试验结果，将患者分为Hp阳性胃癌组(n=83)和Hp阴性胃癌组(n=41)；根据组织病理结果，将Hp阳性胃癌患者分为早期胃癌组(n=29)和中晚期胃癌组(n=54)。早期胃癌指病灶局限于黏膜及黏膜下层，不考虑病灶大小和淋巴结转移情况；中晚期胃癌指病灶达肌层或浆膜层[4]。排除标准：(1)合并其他恶性肿瘤；(2)合并甲状腺功能异常；(3)术前曾口服激素、非甾体抗炎药、避孕药或进行抗Hp治疗者；(4)临床资料缺失者。

1.2 实验试剂

鼠抗人β-肌动蛋白(β-actin)、NOD1、NOD2、NF-κB及caspase-3抗体均购自美国R&D公司；山羊抗兔IgG二抗、中性树脂及DAB显色液试剂盒均购自北京百奥莱博科技有限公司；实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)试剂盒购自日本TaKaRa公司。

1.3 方法

1.3.1免疫组织化学法检测NOD1和NOD2的表达水平

将124例胃癌患者胃癌组织的石蜡标本连续切片5张，用5%血清于室温下封闭40 min，分别加入NOD1和NOD2的单抗进行孵育，置于4 ℃条件下过夜。复温后加入二抗，37 ℃孵育30 min，PBS清洗后加入SP进行40 min恒温反应，显色后使用中性树脂封片。显微镜下可见细胞内的棕黄色颗粒，即为NOD1和NOD2阳性表达。随机选择显微镜下的6个高倍视野(×40)，计算平均光密度(mean optical density，MOD)，MOD=累计光密度/面积。

1.3.2实时荧光定量PCR检测NOD1和NOD2的mRNA表达水平

以Trizol法提取总RNA，再将RNA逆转录合成cDNA，最后以β-actin为内参进行实时荧光定量PCR。NOD1上游引物：5′-AAG CAT TTC TGC TAC CCG GAG-3′；下游引物：5′-AAG CAT TTC TGC TAC CCG GAG-3′。NOD2上游引物：5′-CCG TGT CCT GTT AAC CTT TG-3′；下游引物：5′-AGG ATC AGC AGG TAC ATG TC-3′。内参上游引物：5′-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3′；下游引物：5′-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3′。根据2-ΔΔCt公式计算目的基因mRNA的相对表达水平。

1.3.3Western blot检测caspase-3和NF-κB的表达水平

将标本在冰上裂解2 h后离心，使用 BCA试剂盒检测蛋白浓度，将样本蛋白浓度调整至30 μg/μL。蛋白样本电泳后转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，按照1∶1 000加入一抗和二抗。样本进行ECL显色后，使用Bio-Pro凝胶分析仪和Quantity-one 软件进行灰度扫描，得出各条带蛋白表达水平。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 一般临床资料比较

两组患者一般临床资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1一般临床资料比较

2.2 Hp阴性胃癌组和Hp阳性胃癌组NOD1、NOD2蛋白的表达水平比较

Hp阴性胃癌组和Hp阳性胃癌组NOD1、NOD2蛋白的免疫组织化学染色强度差异均有统计学意义(P<0.05)，见图1、2；经光密度检测，Hp阴性胃癌组和Hp阳性胃癌组NOD1、NOD2蛋白表达水平差异均有统计学意义(P<0.05)，其中Hp阳性胃癌组中NOD1和NOD2蛋白均呈高表达，见表2。

A：Hp阴性胃癌(×400)；B：Hp阳性胃癌(×400)。

A：Hp阴性胃癌(×400)；B：Hp阳性胃癌(×400)。

2.3 Hp阴性胃癌组和Hp阳性胃癌组NOD1、NOD2 mRNA的表达水平比较

Hp阴性胃癌组和Hp阳性胃癌组NOD1、NOD2 mRNA的表达水平差异均有统计学意义(P<0.05)，其中Hp阳性胃癌组NOD1和NOD2 mRNA均呈高表达，见表3。

表2 NOD1和NOD2蛋白表达水平比较

表3 NOD1和NOD2 mRNA的表达水平比较

2.4 Hp阳性的早期和中晚期胃癌caspase-3、NF-κB的表达水平比较

Hp阳性的早期和中晚期胃癌组间caspase-3、NF-κB的表达水平差异均有统计学意义(P<0.05)，其中中晚期胃癌组caspase-3和NF-κB的表达水平均高于早期胃癌组，见图3和表4。

图3 Hp阳性早期和中晚期胃癌组caspase-3和NF-κB的表达水平

表4 caspase-3和NF-κB的表达水平比较

3 讨 论

流行病学研究表明，胃癌与Hp感染有很强的相关性，早在1994年WHO已将Hp列为胃癌的Ⅰ类致癌因子[5-6]。我国Hp感染率超过50%，这也是中国胃癌发生率和死亡率较高的重要原因。目前关于Hp感染的致病机制主要有以下几种学说，即基因学说、促胃液素联系学说、漏顶学说和免疫学说，其中免疫学说越来越为人们所关注。该观点认为Hp长期定植于胃黏膜表面，可通过黏附作用和产生多种毒力因子对胃黏膜细胞造成直接损伤[7]。此外，机体对Hp的炎性反应而导致的组织损伤也是胃溃疡、慢性胃炎、胃癌及胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤发生的原因之一。Hp感染后机体免疫系统被激活，单核细胞和中性粒细胞可诱导产生一氧化氮(NO)、白细胞介素(IL)-2、IL-6及氧自由基，进而导致炎症损伤[8]。

大多数感染Hp的患者表现为胃炎，只有少部分患者发展为胃癌，这其中宿主免疫应答对Hp的感染结局至关重要[9]。Hp通过激活识别病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)的受体来触发炎症，而这些PAMPs是通过一组生殖系编码的模式识别受体(pattern recognition receptors，PRRs)识别的。PRRs的激活可诱导一系列促炎细胞因子的表达迅速增加，其在先天和获得性免疫反应中均发挥着重要作用。NOD1和NOD2是一类位于细胞质中的PRRs，它们的分子结构包括1个中心节点、1个N端效应器结合结构域和1个由富含亮氨酸重复序列组成的C端配体识别结构域。NOD1可识别主要存在于革兰阴性细菌中的神经肽，而NOD2可识别肽聚糖合成或降解过程中产生的成分[10]。目前已有研究[11]表明，NOD1和NOD2可通过激活NF-κB、STAT1等转录因子，在炎症相关肿瘤的发生发展中发挥重要作用。NF-κB是一种具有多向调节作用的核蛋白因子，参与机体氧化应激、炎症及细胞增殖等病理生理过程，被激活后可活化效应性caspase-3，参与调控凋亡基因的转录，最终导致细胞核DNA链断裂和细胞凋亡[12]。

本研究发现Hp阴性和Hp阳性胃癌患者一般临床资料无明显差异，具有可比性；NOD1和NOD2在Hp阳性胃癌标本中蛋白和mRNA的表达水平均高于Hp阴性胃癌标本，表明NOD1和NOD2在Hp阳性胃癌的发生过程中发挥重要抑制作用。Hp阳性中晚期胃癌标本中NF-κB和caspase-3的表达水平高于Hp阳性早期胃癌标本，表明随着胃癌的发展NF-κB通路和caspase-3的活化增强，NOD1和NOD2所发挥的凋亡效应也随之增强。有报道[13]指出，中国汉族人群NOD1的基因多态性与胃癌发生相关。另有动物研究[14]发现，NOD1缺陷的小鼠更容易受到具有功能型Ⅳ分泌系统的HP菌株感染，在野生型小鼠中，Hp感染后NOD1信号通路被激活，致使IL-1β的表达增加，而IL-1β可诱导和放大天然及适应性免疫反应，这进一步证实了NOD1与Hp 感染相关性胃病发生发展的相关性。有研究[15]表明，在慢性萎缩性胃炎-胃黏膜肠上皮化生及不典型增生-胃癌这一病理进展过程中，NOD2的表达率和表达强度逐渐升高，推测NOD2与胃癌的发生发展存在联系，并可在一定程度上作为诊断疾病的参考指标。

综上所述，NOD1和NOD2通过激活NF-κB通路进而活化凋亡因子caspase-3，最终诱导肿瘤细胞的凋亡，在Hp阳性胃癌的发生发展过程中发挥着一定作用，但具体作用机制还有待进一步阐明。胃黏膜组织中NOD1和NOD2的表达增加，可在一定程度上提示Hp阳性胃癌的发生及发展程度，此外检测NF-κB和caspase-3的表达水平也可为临床诊断提供重要的参考信息。