浓香型白酒窖泥微生物群落多样性及理化因素对其影响

胡晓龙，余苗，王康丽，田瑞杰，杨旭，王永亮，张治刚，赵西民，何培新*

（1.郑州轻工业大学食品与生物工程学院，河南 郑州 450001；2.贾湖酒业集团有限责任公司，河南 漯河 462400；3.河南省张弓酒业有限公司，河南 商丘 476700）

浓香型、清香型、酱香型和米香型为中国白酒四大基本香型，其中浓香型白酒占整个白酒行业销量的70%左右。浓香型白酒的生产是以高粱、大米、玉米等谷物为原料，经固态发酵、蒸馏、陈酿、勾兑而成，其具有窖香浓郁、绵甜醇厚、香味协调、回味悠长等特征，深受消费者青睐[1]。窖泥是浓香型白酒生产的重要微生物来源之一，其复杂的微生物群落与浓香型白酒品质密切相关[2-3]。例如，产己酸菌属为浓香型白酒主体香己酸乙酯的合成提供前体物质己酸，张应刚[4]的研究中表示甲烷菌与其共生有助于提升己酸产量。为了阐明窖泥对白酒生产的影响，窖泥微生物群落多样性以及理化性质对其影响成为研究的热点[5]。其中随着窖泥质量增加，厚壁菌门（Firmicutes）呈下降趋势，而拟杆菌门（Bacteroidetes）和广古菌门（Euryarchaeota）呈增加趋势[2，4]，窖泥中细菌总量与窖泥理化因子pH值、铵态氮和有效磷呈正相关[6]，趋老熟和老熟状态的窖泥样品中梭菌属（Clostridium）的优势较为明显。窖泥中微生物群落非常复杂，其组成与窖池窖龄[5]和空间位置[7]有关。Tao等[5]研究结果指出随着窖龄增加（0～25年），窖泥微生物菌群结构不断变化并趋于稳定，老窖窖泥微生物群落结构处于均衡状态且窖泥微生物多样性高。此外，窖泥微生物群落多样性和组成明显受窖泥理化性质的影响，且两者之间存在交互作用[8-10]。窖泥pH值与拟杆菌门（Bacteroidetes）呈极显著（P<0.01）正相关，而与乳酸杆菌属（Lactobacillus）呈极显著（P<0.01）负相关，铵态氮含量与广古菌门（Euryarchaeota）呈极显著（P<0.01）正相关等[5，8]。

高通量测序技术能更为全面地认识目标环境中微生物群落信息[7，11-12]，已广泛应用于窖泥微生物群落多样性和组成解析，但目前研究主要集中在四川、安徽等浓香型白酒产区，尤其是四川产区[7，11]。河南作为我国白酒主产区之一，主要以浓香型白酒企业为主，在2016年河南白酒产量为117.50万千升，位居全国第二[13]。但针对该产区的窖泥微生物群落多样性及其组成研究相对较少。因此，本研究以河南某知名浓香型白酒企业4年和40年窖壁泥和窖底泥为研究对象，采用高通量测序技术解析其中窖泥原核微生物群落多样性和组成，结合冗余相关分析（redundancy analysis，RDA）揭示其与窖泥理化因素之间的相关性，有助于阐明影响窖泥微生物群落演替的理化因素。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

1.1.1 试剂

氢氧化钠、酚酞、邻苯二甲酸氢钾、浓硫酸（ρ=1.84 g/mL）、盐酸（ρ=1.19 g/mL）、苯酚、亚硝基铁氰化钾、高氯酸钠、氯化铵、酒石酸锑钾、钼酸铵、氟化铵、硼酸：国药集团化学试剂有限公司，所有试剂均为分析纯。Magen HiPureSoilDNAKit试剂盒：广州美基生物科技有限公司。

1.1.2 仪器

UV BlueStar A紫外分光光度计：北京莱伯泰科仪器股份有限公司；TGL-20M高速冷冻离心机：上海卢湘仪离心机仪器有限公司；PB-10 PH计：德国Sartorius公司；MP200A精密电子天平：上海良丰仪器仪表有限公司；101-1电热鼓风干燥箱：北京中兴伟业仪器有限公司；DF-1集热式恒温磁力搅拌锅：金坛市中大仪器厂。

1.2 试验方法

1.2.1 窖泥取样方法

窖泥样品均取自豫酒产区某浓香型白酒企业。针对该企业新窖（4年，XJ）和老窖（40年，LJ）两类窖池进行取样，其中随机选取正常使用的新窖2口（XJ1和XJ2），老窖 4 口（LJ1、LJ2、LJ3 和 LJ4），分别选取每口窖池窖壁及窖底两个位置的窖泥样品混合样作为该窖池的窖壁泥（B）和窖底泥（D）代表样品。共计12个窖泥代表样（表1），于-30℃保存备用。采集窖泥样品及编号见表1，窖泥取样位置见图1。

表1 采集窖泥样品及编号Table 1 Collect samples and numbers of pit mud

图1 窖泥取样位置Fig.1 Collection sample location of pit mud

1.2.2 理化指标检测方法

参照李俊辉等烘干法和电位法分别测定窖泥含水量及pH值[12]。采用酸、碱中和滴定法测定总酸含量[14]。采用靛酚蓝比色法测定窖泥中铵态氮含量[15]。参照NY/T 1121.7—2014《中华人民共和国农业行业标准》，第7部分：土壤有效磷的测定检测窖泥中有效磷含量[16]。

1.2.3 窖泥基因组提取、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）及高通量测序

采用Magen HiPure Soil DNA Kit试剂盒参照步骤说明对窖泥样品DNA进行提取，使用QubitdsDNA HS Assay Kit检测DNA浓度。采用上游引物5′-CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT-3′和下游引物 5′-GGACTACNVGGGTWTCTAATCC-3′，对原核生物16S rRNA基因的V3和V4区进行扩增。

PCR扩增反应体系：TransStart Buffer 2.5 μL、dNTPs 2 μL、TransStart Taq DNA 0.5 μL、模版 20 ng、上下游引物各1μL，用ddH2O（双蒸水）补足体积到25μL。

反应条件：预变性94℃ 3 min，变性 94°C 5 s，退火 57℃90 s，延伸 72℃10 s，终延伸72℃ 5 min，24个循环。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，将合格的PCR产物委托苏州金唯智生物科技有限公司进行高通量测序文库构建及Illumina MiSeq双端测序。

1.3 数据处理

采用 Cutadapt（v1.9.1）、Vsearch（1.9.6）及 Qiime（1.9.1）软件对高通量测序序列进行质控，包括序列拼接、去掉含有N的序列、去除引物和接头、去除质量值<20的碱基及长度<200 bp的序列及去除嵌合体。经过质控的序列使用VSEARCH（1.9.6）进行序列聚类，其中相似性设为97%归为1个OUT。利用贝叶斯算法（Ribosomal database program，RDP）对操作分类单元（operational taxonomic units，OTU）数量的代表性序列进行物种分类学分析，并在不同物种分类水平下统计每个样本的群落组成。基于OTU得到分析结果，采用对样本序列进行随机抽平的方法，分别计算香农（Shannon）指数、Chao1指数等α-多样性指数。采用SPSS（IBM19）软件完成方差分析及聚类分析；利用O－rigin9.0绘制窖泥样品优势（平均相对含量大于1%）菌门与优势菌纲百分比柱状图；采用HemI软件绘制热图；采用Canoco 5软件绘制RDA图谱。

2 结果与讨论

2.1 窖泥理化性质分析

不同窖泥理化性质、原核微生物群落OTU数量及其α-多样性见表2。

窖泥理化性质分析表明，4组窖泥理化因子除含水量外，其它理化因子均存在显著性（P＜0.05）差异（表2）。4组窖泥样品分类中新窖窖底泥pH值显著高于其他几组（P＜0.05），老窖窖底泥pH值最低。新窖窖底泥（60.88 mg/100 g）和老窖窖壁泥（53.64 mg/100 g）铵态氮含量显著高于其它组窖泥（P＜0.05）。除老窖窖壁泥外，新窖窖底泥有效磷含量显著高于其他组窖泥（P＜0.05）。此外，老窖窖壁泥和窖底泥只有铵态氮含量存在显著性差异（P＜0.05）；新窖窖壁泥和窖底泥的理化因子含量（含水量除外）均存在显著性差异。而上述理化性质差异将导致不同类型窖泥微生物群落结构存在差异，且两者之间存在交互作用。例如，窖泥pH值可以直接和间接影响微生物生长繁殖[8-9，17]，低pH值将有利于耐酸的乳酸杆菌属富集，而其它最适pH值为近中性或微偏酸的梭菌纲（Clostridia）、甲烷杆菌纲（Methanobacteria）、甲烷微菌纲（Methanomicrobia）及拟杆菌纲（Bacteroidia）等微生物数量将减少[18-20]；铵态氮和有效磷为微生物生长和代谢提供速效营养物质。同时，窖泥微生物群落变化将会引起窖泥理化性质改变，如乳酸杆菌属（Lactobacillus）的富集可以导致其代谢物乳酸的积累，进而导致窖泥pH值下降[5]；沉积菌属（Sedimentibacter）具有降解氨基酸及提高铵态氮的能力[21]。

表2 不同窖泥理化性质、原核微生物群落OTU数量及其α-多样性Table 2 Physicochemical properties，number of OTUs of prokaryotic microbial communities and α-diversity in pit mud from different pit

2.2 窖泥微生物α-多样性分析

由表2可见，随着窖泥窖龄增加和位置的深度增加，窖泥的OTU数分别均呈现降低的趋势，但无显著性（P＞0.05）差异。窖泥Chao1指数和ACE指数变化规律与OTU数的变化趋势一致。新窖窖壁泥和新窖窖底泥α-多样性指数均没有显著性（P＞0.05）差异；老窖窖底泥Shannon指数和辛普森（Simpson）指数显著性（P＜0.05）低，而其它组窖泥之间没有显著差异。结合窖泥理化性质分析，可发现窖泥pH值变化与Shannon指数变化一致，推测pH值与窖泥物种丰度和多样性呈一定的正相关，与胡晓龙等研究结果一致[8，22]。

2.3 窖泥微生物群落β-多样性分析

2.3.1 窖泥微生物群落门和纲水平上组成

基于OTU注释，对窖泥样品中微生物群落门水平和纲水平相对丰度进行分析，结果见图2。

图2 窖泥样品优势菌门相对丰度和窖泥样品优势菌纲相对丰度Fig.2 Relative abundance of dominant phylum and class in pit mud samples

所有窖泥样品中共检测到15个门，由细菌和古菌构成，分别占96.3%和3.7%。厚壁菌门（Firmicutes，63.56%）、变形菌门（Proteobacteria，15.19%）、拟杆菌门（Bacteroidetes，14.42%）、广古菌门（Euryarchaeota，4.32%）和放线菌门（Actinobacteria，1.6%）为优势（平均含量>1%）菌门（图2a）。其中Firmicutes为绝对优势菌门，在所有样品中平均含量均最高。Bacteroidetes和Euryarchaeota在新窖窖底泥和老窖窖壁泥中含量都较高，与已报道的正常窖泥和优质窖泥原核菌群结构更为相似[8]。Proteobacteria在新窖样品平均相对含量（28.92%）较高，而老窖中其含量急剧下降，与张应刚等研究结果一致[11]。此外，绿弯菌门（Chloroflexi）和螺旋体门（Spirochaetes）等为该酒企窖泥中的稀有菌门（平均含量<0.01%）。

在纲水平共检测到29个纲，包括6个优势（平均相对含量>1%）菌纲，即芽孢杆菌纲（Bacilli）、梭菌纲（Clostridia）、拟杆菌纲（Bacteroidia）、γ-变形杆菌纲（Gammaproteobaoteria）、甲烷杆菌纲（Methanobacteria）和甲烷微菌纲（Methanomicrobia）（图2b）。其中Bacilli（74.20%）在老窖窖底泥中占绝对优势，梭菌纲（Clostridia）是新窖窖底泥（31.24%）和老窖窖壁泥（43.29%）中的第一大优势菌纲。此外，甲烷菌数量和代谢能力可能是窖泥老熟的重要标志之一[23]，且其与梭菌属的协同作用可提高白酒主体香味己酸乙酯含量[4，8]，Methanobacteria（9.61%）和 Methanomicrobia（2.76%）在新窖窖底泥中总丰度含量最高，其次为老窖窖壁泥，含量分别为3.42%和0.74%；Clostrdia含量一般随着窖泥的窖龄和质量增加而增加[5，8]，其在新窖窖底泥和老窖窖壁泥中都为第一优势菌，在一定程度上反映了新窖窖底泥和老窖窖壁泥质量及老熟程度可能要高于新窖窖壁泥和老窖窖底泥。

2.3.2 窖泥属水平微生物群落组成

基于OTU注释，对窖泥样品中优势菌属（所有样品中平均相对含量大于1%）按照门水平分类进行聚类，结果见图3。

图3 基于优势属的物种进化树Fig.3 Evolutionary tree based on dominant genera

共检测到179个属，有12个优势（所有样品中平均相对含量大于1%）菌属，即乳酸杆菌属（Lactobacillus，36.84%）＞产己酸菌属（Caproiciproducens，14.30%）>不动菌属 （Acinetobacter，4.43%）>理研菌属（Petrimonas，4.30%）>梭菌属-12（Clostridium_sensu_stricto_12，4.23%）>Proteiniphilum （4.00%）>Prevotella_7（2.54%）>假单胞菌属（Pseudomonas，2.37%）>甲烷短杆菌属（Methanobrevibacter，1.96%）>氢孢菌属（Hydrogenispora，1.32%）>沉积菌属（Sedimentibacter，1.29%）>梭菌属-1（Clostridium_sensu_stricto_1，1.19%）。系统发育树分析表明上述优势属分属于Firmicutes、Proteobacteria、Bacteroidetes和Euryarchaeota门，其中主要集中于Firmicutes门，与我国四川、贵州等浓香型白酒产区窖泥研究中优势属种类一致性较高[5，24]。

选取每个窖泥样品中含量前十的菌属进行热图分析，占每个样品含量88.8%～99.2%，共43个属，结果见图4。

图4 窖泥样品含量前十的属Fig.4 Top 10 genera of pit mud samples

热图分析进一步揭示了不同窖龄、窖池位置窖泥微生物属水平上的差异。其中新窖和老窖样品分别聚为簇i和簇ii，表明不同窖龄窖泥含量前十的属存在明显差异。例如，优势菌属Lactobacillus、Caproiciproducens和Prevotella_7在老窖中含量高于新窖，而其它优势菌属在新窖窖泥中含量高。不同窖池空间位置窖泥含量前十的属也存在明显差异。例如，Petrimonas（12.23%）、Proteiniphilum（9.18%）和 Methanobrevibacter（9.87%）含量在新窖窖底泥显著（P＜0.05）高于其它组窖泥，其次是老窖窖壁泥（P＞0.05）；Caproiciproducens在老窖窖壁泥中含量最高（17.95%）。Clostridium和Caproiciproducens在老窖、质量较高窖泥中含量较高，是我国其它产区（四川、江苏等）老窖泥和正常窖泥的主要功能菌[5，10，22]；新窖中部分菌属如 Pseudomonas、Hydrotalea、Clostridium_sensu_stricto_1 等随窖池位置深入丰度减少，而另一部分菌属Methanobrevibacter、Proteiniphilum、Petrimonas等随着窖池位置深入丰度增加成为优势菌属，且老窖中大部分菌属不会随窖池位置深入丰度发生较大变化。此外，部分非优势菌属如Bacillus、Hydrotalea等仅在新窖中占有一定的丰度，在老窖中含量极少。汇总相关文献发现[4-5，22]，部分前十属在窖泥生境中具有对浓香型白酒重要风味物质形成及维持窖泥微生态平衡的作用或潜力。例如，Clostridium属是窖泥中重要功能菌之一，其相应的种（如C.kluyveri和C.tyrobutyricum）在厌氧或兼性厌氧条件下能将有机物转化为有机酸（己酸、丁酸等），与醇类反应生成各种衍生物己酸乙酯和丁酸乙酯[10]，其为浓香型白酒中重要的呈香物质。Sedimentibacter属能代谢氨基酸，其分解产物铵态氮可以作为窖泥中微生物的氮源[21]。Petrimonas属具有代谢糖类生成乙酸、氢气和CO2的功能[24]。Hydrogenispora可利用葡萄糖产乙酸、乙醇和H2[25]。Caproiciproducens会加快利用碳源转化为乙醇、乙酸、丁酸、己酸，是窖泥中产己酸的重要菌群，其代谢副产物主要是H2。氢营养型甲烷菌（Methanobrevibacter）主要利用氢气和甲基类化合物生成甲烷，实现了窖泥中氢转移，解除窖泥中氢对微生物生长繁殖的抑制作用；其与己酸菌共生时使其反应向有利于产生己酸的方向进行[26]。

2.4 窖泥理化因子与窖泥优势菌属的冗余分析（RDA）

如前所述，窖泥理化性质影响窖泥微生物组成。冗余分析进一步分析了窖泥理化性质与窖泥优势菌属之间的相关性，结果见图5。

图5 窖泥理化因子与平均含量优势属（12个）的冗余分析Fig.5 Redundancy analysis of physicochemical factors and dominant genus（12 numbers）with average content

图中箭头的长度代表相关性的大小，中心点和窖泥菌群之间的连线与箭头的夹角为锐角表示窖泥优势菌属与相应的理化因子呈正相关，钝角表示负相关。图5中两个主成分总解释度51.98%，主要集中在Axis1（32.68%）。所有窖泥样品共聚为4类，同一类窖泥样品单独表明优势微生物群落组成相似。其中同一窖龄不同空间位置的窖泥样品基本分布在Axis1轴0刻度垂直线的两侧；新、老窖泥在Axis2轴上能较好地区分开来，其中新窖窖泥主要分布在图5第一象限和第二象限，老窖窖泥主要分布在图5第三象限和第四象限。这种新老窖泥及不同位置窖泥微生物群落差异是由多种理化因子共同作用引起的，如新窖窖底泥与pH值、铵态氮和有效磷呈正相关；新窖窖壁泥与除了总酸外其它理化因子呈负相关，尤其是铵态氮和有效磷。条件限制分析（conditional term effects）揭示了每个理化因子对优势菌群结构影响程度，其中总酸（30.7%）对优势菌属影响最大，具有极显著贡献（P<0.01），其次是 pH值（15.7%，P＜0.05），其它依次为铵态氮（8.5%）＞含水量（4.1%）＞有效磷（2.7%），不具有显著性（P＞0.05）。pH值能区分不同质量等级窖泥，其与铵态氮和有效磷对窖泥质量影响最大[17，27]。目前关于新老窖泥菌群差异的研究[8，28]均表明pH值与优质老窖泥的菌群呈强烈正相关，总酸与新窖泥或者退化窖泥的菌群呈强烈正相关。综上，pH值、总酸和铵态氮是影响不同窖龄和不同窖池位置窖泥中优势微生物菌群分布的主要理化因子，尤其是总酸和pH值。

3 结论

本文分析了一家豫酒企业新、老窖池中窖壁和窖底窖泥样品的理化性质及其原核菌群结构，其中窖泥样品含水量（31.76%～35.29%）、pH 值（4.08～8.52）、总酸（1.19 mg/g～10.07 mg/g）、铵态氮（4.19 mg/g～60.88 mg/100g）和有效磷（2.08 mg/100g～14.04mg/100 g），在不同类窖泥中存在一定的差异。Observed OTU、Chao1指数和ACE指数在不同分组窖泥中没有显著性（P＞0.05）差异，除老窖窖底泥香农指数和辛普森指数显著性（P＜0.05）低，其它组没有显著性差异。窖泥β-多样性表明，窖泥中厚壁菌门（Firmicutes）占绝对优势，其中 Bacteroidetes（23.83%） 和 Euryarchaeota（8.35%）在新窖窖底泥和老窖窖壁泥中含量都较高；纲水平上，芽孢杆菌纲（Bacilli，74.20%）在老窖窖底泥中占绝对优势，梭菌纲（Clostridia）在新窖窖底泥（31.24%）和老窖窖壁泥（43.29%）中为第一大优势菌纲；属水平上，12 个优势属主要有 Lactobacillus、Caproiciproducens、Acinetobacter等，隶属于 4个菌门，且有6个优势菌属（除未分类的菌属）隶属于厚壁菌门（Firmicutes）。RDA分析表明总酸和pH值对窖泥优势菌群相关性解释度最高，表明总酸和pH值是影响窖泥优势菌群分布的主要理化因子。