新型噻唑-肉桂酸杂合体的设计、合成及黄嘌呤氧化酶抑制活性

陈 赛, 李洪雷, 刘 娟, 李 飞

(1. 南京医科大学 药学院，江苏 南京 211166 ； 2. 南京医科大学 康达学院，江苏 连云港 222000)

痛风是由于长期体内尿酸过多导致的尿酸单钠晶体在关节沉积引起关节发炎的疾病[1]。高尿酸血症是导致痛风的主要因素，据不完全统计，全世界高尿酸血症患者中大约有5 %～12 %的病人会转化为痛风患者[2]。并且随着经济社会的发展，痛风的发病率也在逐渐上升，而且发病年龄正在趋于年轻化[3]。当关节处尿酸长时间处于高水平后，尿酸会不断堆积，形成结晶，导致关节反复发炎疼痛甚至畸形。除此之外，高尿酸血症还和代谢紊乱[4]、糖尿病[5]、慢性心力衰竭[6]、高血压、心血管疾病[7]、肾疾病[8]、动脉粥样硬化[9]、痴呆[10]等有关。

Chart 1

目前上市的治疗高尿酸血症的药物只有两类，一类是：促进尿酸排泄的药，如：苯溴马隆、丙磺舒等；另一类是抑制尿酸生成药，如别嘌醇，非布司他，托比司他等(Chart 1)。目前对于非布司他结构修饰的方法主要有3类：第一类是将五元噻唑环变成其他五元杂环如吡唑、咪唑、噻吩、三氮唑等[11-12]；第二类是将五元噻唑环变成其他六元杂环如吡啶、嘧啶等[13-14]；第三类是增加苯环与杂环之间的连接键如用酰胺键、醚键连接，如化合物(1～3)等[15-17](Chart 2)。结合非布司他的作用机制[18]以及现有对非布司他结构修饰的方法，保留其整个噻唑环，在二位上引入氨基后与同样具有治疗高尿酸血症的阿魏酸类[19]结构形成酰胺结构得到目标化合物(Scheme 1)。

Chart 2

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

WRR型熔点仪；Bruker ARX-300型核磁共振仪(DMSO-d6为溶剂，TMS为内标)；Agilent-1100 型质谱仪；N4S型紫外可见分光光度计。

黄嘌呤氧化酶(西格玛奥德里奇公司)；其余所用试剂均为分析纯。

1.2 合成

(1)1的合成[20]

称取N-溴代丁二酰亚胺1.78 g(10 mmol)和对甲苯磺酸10 mg溶解于30 mL二氯甲烷中。在冰浴下，加入乙酰乙酸乙酯1.3 g(10 mmol)，反应0.5 h(TLC检测)。反应完成后，浓缩，得白色固体，100 mL石油醚萃取，过滤，浓缩得无色黏稠状液体1.7 g，收率81 %。

(2)2的合成[21]

称取2-溴乙酰乙酸乙酯2.09 g(10 mmol)和硫脲0.76 g(10 mmol)溶解于15.4 mL水中，55 ℃反应4 h(TLC检测)。反应结束后，加水稀释，氨水调节pH至有固体析出，过滤，干燥，得白色固体1.7 g，收率90 %， m.p.170～173 ℃;1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 7.71(s, NH2), 4.14(dd,J=5.0 Hz, 10.0 Hz, 2H), 2.85(s, 3H), 1.22(t,J=5.0 Hz, 10.0 Hz, 3H)。

Scheme 1

(3)3a～3n的合成通法[22]

称取取代苯甲醛10 mmol和丙二酸3.12 g(30 mmol)溶解于6 mLN,N-二甲基甲酰胺和1 mL吡啶的混合溶液中，90 ℃反应4 h(TLC检测)。反应结束后，加水15 mL，浓盐酸调节pH到1，冷却至0 ℃后有白色固体析出，过滤，冷水洗涤两次，烘干，得目标产物，收率60%～83%。

(4) 4a～4n的合成通法[16]

称取取代肉桂酸1 mmol和2-氨基-4-甲基噻唑-5-羧酸乙酯0.186 g(1 mmol)溶解于10 mL吡啶中，冰浴下加入三氯氧磷0.5 mL后继续搅拌30 min，恢复至室温，继续反应5 h(TLC检测)。反应结束后，加入800 mL冰水，待冰完全融化后，过滤，得目标产物，收率为20%～50%。

(5) 5a～5n的合成通法[17]

称取2-取代肉桂酰胺基-4-甲基噻唑-5-羧酸乙酯0.2 mmol溶解于6 mL混合溶剂中(乙醇/水=2/1,V/V)，加入氢氧化钠0.16 g(4 mmol)，55 ℃反应2 h(TLC检测)。反应结束后，减压除去溶剂，二氯甲烷萃取，分离水层后过滤，滤液用1 M的盐酸调节pH至4，有固体析出，过滤，即得目标产物。

3,4,5-三甲氧基肉桂酰胺基-4-甲基噻唑-5-羧酸(5a)： 棕色固体，收率77%, m.p.255～258 ℃；1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 12.54(brs, COOH), 7.71(d,J=15.7 Hz, 1H), 6.99(s, 2H), 6.86(d,J=15.8 Hz, 1H), 3.84(s, 6H), 3.72(s, 3H), 3.46(brs, NH), 2.55(s, 3H);13C NMR(125 MHz, DMSO-d6)δ: 164.33, 164.11, 159.72, 156.06, 153.59, 143.78, 140.07, 130.20, 118.86, 116.11, 106.08, 60.62, 56.41, 17.41; MS(ESI)m/z: 379.1{[M+H]+}。

肉桂酰胺基-4-甲基噻唑-5-羧酸(5b)： 棕色固体，收率37%， m.p.253～256 ℃；1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 12.38(brs, COOH), 7.78(d,J=15.8 Hz, 1H), 7.65(dd,J=7.5 Hz, 1.9 Hz, 2H), 7.50～7.45(m, 3H), 6.90(d,J=15.9 Hz, 1H), 3.40(brs, NH), 2.56(s, 3H);13C NMR(125 MHz, DMSO-d6)δ: 164.24, 164.11, 159.74, 156.04，143.68，134.61, 131.01, 129.57, 128.57, 119.54, 116.19, 17.41; MS(ESI)m/z: 289.1{[M+H]+}。

2-硝基肉桂酰胺基-4-甲基噻唑-5-羧酸(5c)： 棕色固体，收率69%， m.p.261～263 ℃；1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 12.82(brs, COOH), 8.12(d,J=10.0 Hz, 1H), 8.05(d,J=15.7 Hz, 1H), 7.85(m, 1H), 7.80(d,J=5.0 Hz, 1H), 7.71(m, 1H), 6.86(d,J=15.6 Hz, 1H), 3.44(brs, NH), 2.56(s, 3H);13C NMR(125 MHz, DMSO-d6)δ: 164.05, 163.54, 159.51, 156.03, 148.73, 138.98, 134.61, 131.48, 130.10, 129.44, 125.35, 124.08, 116.49, 17.39; MS(ESI)m/z: 334.0{[M+H]+}。

3,4-二氯肉桂酰胺基-4-甲基噻唑-5-羧酸(5d)： 棕色固体，收率50%， m.p.252～257 ℃;1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 12.67(brs, COOH), 7.93(d,J=5.0 Hz, 1H), 7.77(s, 1H), 7.75～7.72(m, 1H), 7.64(m, 1H), 6.93(d,J=15.9 Hz, 1H), 3.40(brs, NH), 2.55(s, 3H)；13C NMR(125 MHz, DMSO-d6)δ: 164.06, 163.83, 159.57, 155.90, 140.92, 135.49, 133.30, 131.71, 130.58, 128.02, 121.76 , 119.60, 116.44, 17.47; MS(ESI)m/z: 357.0{[M+H]+}。

4-硝基肉桂酰胺基-4-甲基噻唑-5-羧酸(5e)： 棕色固体，收率50%， m.p.280～281 ℃;1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 12.81(brs, COOH), 8.31(d,J=8.8 Hz, 1H), 7.91(d,J=8.9 Hz, 1H), 7.88(d,J=15.9 Hz, 1H), 7.05(d,J=15.9 Hz, 1H), 3.49(brs, NH), 2.56(s,3H)；13C NMR(125 MHz, MHz, DMSO-d6)δ: 164.07, 163.65, 159.54, 156.34, 148.55, 141.09, 141.04, 129.64, 124.72, 123.66, 116.46, 17.40; MS(ESI)m/z: 334.0{[M+H]+}。

4-溴肉桂酰胺基-4-甲基噻唑-5-羧酸(5f)： 棕色固体，收率61%， m.p.255～258 ℃;1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 12.70(brs, COOH), 7.75(d,J=15.8 Hz, 1H), 7.68(d,J=8.5 Hz, 2H), 7.60(d,J=8.5 Hz, 2H), 6.91(d,J=15.9 Hz, 1H), 3.64(brs, NH), 2.55(s, 3H)；13C NMR(126 MHz, DMSO-d6)δ: 164.09, 159.67, 156.03, 143.09, 142.36, 133.90, 132.57, 130.46, 124.30, 120.34, 116.25, 17.40; MS(ESI)m/z: 367.0{[M+H]+}。

4-氯肉桂酰胺基-4-甲基噻唑-5-羧酸(5g)： 棕色固体，收率74%， m.p.264～268 ℃;1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 12.69(brs, COOH), 7.77(d,J=15.8 Hz, 1H), 7.67(d,J=8.5 Hz, 1H), 7.54(d,J=8.5 Hz, 1H), 6.89(d,J=15.9 Hz, 1H), 3.46(brs, NH), 2.55(s, 3H)；13C NMR(125 MHz, DMSO-d6)δ: 164.09, 164.06, 159.68, 156.03, 142.26, 135.45, 133.56, 130.25, 129.64, 120.28, 116.25, 17.40; MS(ESI)m/z: 323.0{[M+H]+}。

3-溴肉桂酰胺基-4-甲基噻唑-5-羧酸(5h)： 棕色固体，收率63%， m.p.262～264 ℃;1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 12.67(brs, COOH), 7.86(s, 1H), 7.75(d,J=15.9 Hz, 1H), 7.65(t,J=7.5 Hz, 1H), 7.44(t,J=7.5 Hz, 1H), 6.92(d,J=15.9 Hz, 1H), 3.38(brs, NH), 2.56(s, 3H);13C NMR(125 MHz, DMSO-d6)δ: 164.08, 163.92, 159.62, 156.04, 141.93, 137.15, 133.44, 131.65, 131.20, 127.22, 122.81, 121.20, 116.30, 17.40; MS(ESI)m/z: 367.0{[M+H]+}。

3-氯肉桂酰胺基-4-甲基噻唑-5-羧酸(5i)： 棕色固体，收率68%， m.p.260～263 ℃;1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 12.68(brs, COOH), 7.76(d,J=15.9 Hz, 1H), 7.72(s, 1H), 7.64～7.60(m, 1H), 7.53～7.49(m, 2H), 6.92(d,J=15.9 Hz, 1H), 3.40(brs, NH), 2.56(s, 3H)；13C NMR(125 MHz, DMSO-d6)δ: 164.08, 163.94, 159.62, 156.03, 142.00, 136.88, 134.25, 131.39, 130.54, 128.33, 126.85, 121.22, 116.30, 17.39; MS(ESI)m/z: 323.0{[M+H]+}。

2-溴肉桂酰胺基-4-甲基噻唑-5-羧酸(5j)： 棕色固体，收率81%， m.p.254～256 ℃；1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 12.78(brs, COOH), 7.98(d,J=15.7 Hz, 1H), 7.76～7.74(m, 2H), 7.51(t,J=7.5 Hz, 1H), 7.40(td,J=5.0 Hz, 1.5 Hz, 1H), 6.90(d,J=15.7 Hz, 1H), 3.39(brs, NH), 2.56(s, 3H)；13C NMR(125 MHz, DMSO-d6)δ: 164.07, 163.73, 159.58, 156.04, 141.19, 134.13, 133.87, 132.56, 128.98, 128.42, 125.17, 122.74, 116.43, 17.40; MS(ESI)m/z: 366.9{[M+H]+}。

2-氯肉桂酰胺基-4-甲基噻唑-5-羧酸(5k)： 棕色固体，收率33%， m.p.254～256 ℃;1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 12.79(brs, COOH), 8.02(d,J=15.8 Hz, 1H), 7.78～7.74(m, 1H), 7.60～7.57(m, 1H), 7.50～7.46(m, 1H), 6.95(d,J=15.8 Hz, 1H), 3.41(brs, NH), 2.56(s, 3H)；13C NMR(125 MHz, DMSO-d6)δ: 164.06, 163.80, 159.58, 156.04, 139.14, 138.55, 134.28, 132.39, 130.64, 128.43, 128.38, 122.66, 116.41, 17.40; MS(ESI)m/z: 323.0{[M+H]+}。

4-甲氧基肉桂酰胺基-4-甲基噻唑-5-羧酸(5l)： 棕色固体，收率42%， m.p.274～277 ℃;1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 12.55(brs, COOH), 7.73(d,J=15.8 Hz, 1H), 7.61(d,J=8.8 Hz, 2H), 7.03(d,J=8.8 Hz, 2H), 6.74(d,J=15.8 Hz, 1H), 3.82(s, 3H), 3.40(brs, NH), 2.55(s, 3H)；13C NMR(125 MHz, DMSO-d6)δ: 164.51, 164.15, 161.70, 159.89, 156.05, 143.53, 130.39, 127.21, 116.81, 116.02, 115.06, 55.85, 17.41; MS(ESI)m/z: 319.1{[M+H]+}。

3-硝基肉桂酰胺基-4-甲基噻唑-5-羧酸(5m)： 棕色固体，收率65%， m.p.268～271 ℃;1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 12.73(brs, COOH), 8.48(t,J=1.7 Hz, 1H), 8.28(dd,J=10.0 Hz, 1.5 Hz, 1H), 8.10(d,J=7.5 Hz, 1H), 7.91(d,J=15.9 Hz, 1H), 7.77(t,J=8.0 Hz, 1H), 7.07(d,J=15.9 Hz, 1H), 3.59(brs, NH), 2.56(s, 3H)；13C NMR(125 MHz, DMSO-d6)δ: 164.06, 163.76, 159.53, 156.05, 148.77, 141.17, 136.44, 134.58, 131.13, 125.11, 122.81, 122.42, 116.39, 17.39; MS(ESI)m/z: 334.0{[M+H]+}。

2-甲氧基肉桂酰胺基-4-甲基噻唑-5-羧酸(5n)： 棕色固体，收率53%， m.p.271～273 ℃;1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 12.64(brs, COOH), 7.93(d,J=15.9 Hz, 1H), 7.58(dd,J=7.7 Hz, 1.5 Hz, 1H), 7.47～7.42(m, 1H), 7.13(d,J=8.0 Hz, 1H), 7.04(t,J=7.5 Hz, 1H), 7.02(d,J=15.2 Hz, 1H), 3.90(s, 3H), 3.57(brs, NH), 2.55(s, 3H)；13C NMR(125 MHz, DMSO-d6)δ: 164.72, 164.12, 159.84, 158.62, 156.04, 138.87, 132.52, 129.39, 122.96, 121.28, 120.02, 116.09, 112.37, 56.15, 17.42; MS(ESI)m/z: 319.1{[M+H]+}。

2 结果与讨论

2.1 生物活性

黄嘌呤可以被黄嘌呤氧化酶催化产生尿酸，而尿酸在295 nm处会有紫外吸收，所以通过检查295 nm的吸收度值就可以算出尿酸的生成量。25 ℃下，吸取磷酸盐缓冲液3 Ml, 100 μL黄嘌呤氧化酶溶液和50 μL溶解在DMSO中的各种待测化合物(100 μg/mL)，孵育10 min。然后向反应体系中加入配置好的黄嘌呤溶液200 μL。最后在292 nm处记录吸光值，记录10 min,计算单位时间内吸光度的变化[23]。测试结果如下表：

表1 目标化合物的抑制率

2.2 分子对接

化合物5l与非索布坦在黄嘌呤氧化酶(PDB: 1FIQ)对接结果如图1所示：化合物5l与非索布坦分子在黄嘌呤氧化酶的疏水口袋作用方向基本一致，但是它们与氨基酸的结合情况有所不同。其中化合物5l化合物与氨基酸残基Pro-400、 Lys-256、 Leu-257、 Val-258、 Val-259、 Ile-264和Gly-260产生相互作用。非布索坦与氨基酸残基Leu-404、 Gly-260、 Ser-347、 Val-259、 Ala-346、 Thr-262、 Leu-257和Ile-353产生相互作用。

共合成了14个化合物，但活性均低于阳性对照。结合活性测试结果和分子对接情况，原因可能有两点：一是合成的化合物数量太少，取代基的种类太少；二是苯环和噻唑环之间的连接链太长可能超过了黄嘌呤氧化酶的疏水空腔。

图1化合物5l与非布司他活性位点重叠图

本文基于现有药物非布索坦和天然产物查尔酮、肉桂酸的结构特点，通过药物拼接原理，在非布索坦药效团噻唑环2位氨基上引入不同取代基的肉桂酸得到了肉桂酰胺类化合物共计14个，结构均经1H-NMR、13C-NMR和MS确证。对所合成的化合物进行了体外XO抑制活性测试，结果表明，多个化合物显示出一定的XO抑制活性，但活性均低于对照组临床药物别嘌醇，结合化合物结构，分析活性数据，初步构效关系分析，肉桂酸连接取代基活性4位>2位>3位。当向肉桂酸4位引入取代基甲氧基、硝基后，抑制率分别为64.91 %和64.33 %。