氨基-3-氰基丙酸衍生物的合成

孟祥凯, 王小龙, 薛 鑫

(南京中医药大学 药学院，江苏 南京 210046)

Caspase-1属于Caspase家族，也被称为IL-1β转换酶(ICE)，水解切割某些蛋白质，如炎性细胞因子IL-1β和IL-18的前体，从而加工pro-IL-1β和pro-IL-18等炎症因子使其成熟并释放，诱导细胞的炎症反应，因此，Caspase-1在炎症反应中起着核心调控作用[1-4]。此外，Caspase-1还能将甲状腺激素诱导剂Gasdermin D切割成活性形式，介导一种特殊的促炎症的程序性细胞凋亡[5-7]。

Chart 1

目前报道的Caspase-1的合成抑制剂分为两类：一类是针对Caspase-1的生理底物而设计的肽类(Tyr-Val-Ala-Asp)抑制剂，往往在Caspase-1特异识别的天冬氨酸(Asp)处连接一个亲电的基团，如醛基、苯甲酮、卤甲基酮[8-9]。另一类是非肽类小分子有机化合物，由于非肽类小分子抑制剂具有免疫反应小、分子量低、易于穿透血脑屏障，具有较好的药代动力学的性质，受到广泛的关注和开发[10-11]。

Scheme 1

图1NCGC00183434与Caspase 1结合的分子对接模型：(a)带状；(b)填充

肽类Caspase-1抑制剂NCGC00183434具有活性高、易于合成等优点，一直作为Caspase-1靶点研究的阳性对照药，但在临床研究中发现对机体有一定的毒性，因此未能成药[13]。通过研究NCGC00183434的作用方式发现[12](图1)， S1部分处于溶剂区，与蛋白没有直接相互作用，而其他部位均有对应口袋，可与半胱氨酸残基285、精氨酸残基341和179等残基形成相应的氢键，因此，用骨架跃迁的方法对S1部位改造，用吡啶环替换了原来的吡咯环，没有改变分子原来的走向，从而设计出全新结构的非肽类小分子Caspase-1抑制剂(Chart 1)。

阳性药NCGC00183434的合成主要是4个氨基酸的脱保护缩合过程(Scheme 1)，且氨基酸自带手性，合成过程不需要考虑手性问题，合成比较简单。目标化合物为非肽小分子，从整体来看，可分为3部分，其中中间部分含有一个手性中心，可引入一个带有手性且空间位阻较大基团，通过手性诱导的方法保持构型，或者可以通过手性拆分得到所需构型化合物。另外，吡啶5-位溴活性可能较差，直接引入氨基将其取代可能难度较大，尝试先用碘取代吡啶5-位溴，然后再由氨基进行取代(Scheme 2)。

Scheme 2

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

WRS-1B型数字熔点仪；Bruker AV 400 MHz/500 MHz型核磁共振仪(DMSO-d6或CDCl3为溶剂, TMS为内标)；Thermo ScientificTMQ ExactiveTMFocus型四极杆轨道阱质谱仪；Agilent 1260型系列高效液相色谱仪；Shimadzu-8A型高效液相制备色谱仪；SGW-1型自动旋光仪。

原代巨噬细胞(BMDM)，南京医科大学提供；其余所用试剂均为分析纯。

1.2 合成

(1) 化合物2的合成[14-15]

氮气保护下，称取化合物112.0 g(50.7 mmol)溶解于400 mL甲苯中，量取正丁基锂(2.5 M)24.3 mL(60.9 mmol)，-78 ℃下缓慢滴加，滴毕，继续反应3 h，再称取特戊醛5.67 g(66.0 mmol)，缓慢滴加，滴毕，继续反应1 h。恢复至室温后缓慢滴加水20 mL淬灭反应，浓缩，残余经硅胶柱层析(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯=25/1～16/1，V/V) 纯化得无色油状液体9.1 g，产率72.5%;1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 8.07(s, 1H), 7.73(d,J=16.4 Hz, 1H), 6.79(d,J=8.6 Hz, 1H), 5.02(d,J=11.2 Hz, 1H), 2.00(d,J=18.2 Hz, 1H), 0.88(s, 9H); MS(ESI)m/z: 243.9{[M+H]+} 。

(2) 化合物3的合成

称取化合物29.0 g(36.9 mmol)和PCC 9.54 g(44.3 mmol)溶解于150 mL二氯甲烷中, 反应12 h。反应结束后，抽滤，浓缩滤液，残余经硅胶柱层析(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯=24/1,V/V) 纯化得无色油状液体6.6 g，产率74.1%;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 8.68(dd,J=2.3 Hz, 0.6 Hz, 1H), 7.92(dd,J=8.4 Hz, 2.3 Hz, 1H), 7.82(dd,J=8.4 Hz, 0.6 Hz, 1H), 1.43(s, 9H); MS(ESI)m/z: 241.9{[M+H]+} 。

(3) 化合物4的合成[16]

氮气保护下，称取化合物36.5 g(26.8 mmol)，R-(+)-叔丁基亚磺酰胺3.6 g(29.5 mmol)和钛酸四乙酯12.2 g(53.6 mmol)溶解于200 mL无水四氢呋喃中，76 ℃反应16 h。反应完毕后，除去大部分四氢呋喃，加入少量水，有大量白色固体析出，加入300 mL乙酸乙酯溶解，抽滤，分液，合并有机相，浓缩，残余经硅胶柱层析(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯= 24/1,V/V) 纯化得淡黄色固体6.9 g，产率75.1%;1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 8.72(d,J=2.2 Hz, 1H), 8.09(dd,J=8.3 Hz, 2.3 Hz, 1H), 7.29(d,J=8.3 Hz, 1H), 1.17(s, 9H), 1.13(s, 9H); MS(ESI)m/z: 344.7{[M+H]+}。

(4) 化合物5的合成

(5) 化合物6的合成

称取化合物55.5 g(22.6 mmol)溶解于60 mL HCl/dioxane(4 N)混合溶剂中，室温反应5 h。反应结束后，抽滤，滤饼用乙酸乙酯/石油醚(1/1，V/V)洗涤得淡黄色固体5.0 g，产率91.2%;1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 8.76(d,J=2.4 Hz, 1H), 8.52～8.48(m, 2H), 8.14(dd,J=8.3 Hz, 2.4 Hz, 1H), 7.50(d,J=8.4 Hz, 1H), 4.24(q,J=5.8 Hz, 1H), 0.94(s, 9H); MS(ESI)m/z: 242.1 {[M+H]+}。

(6) 化合物7的合成

称取化合物64.9 g(20.0 mmol)，3-氯-4-氨基苯甲酸3.8 g(22.0 mmol)， HATU 9.1 g(24.0 mmol)溶解于80 mL DMF中，缓慢滴加DIPEA 7.8 g(60.0 mmol)，滴毕，继续反应12 h。反应结束后，溶解于200 mL乙酸乙酯中，依次用饱和碳酸氢钠溶液、饱和食盐水洗涤，分液，合并有机相，无水氯化钠干燥，过滤，浓缩滤液，残余物经硅胶柱层析(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯= 7/1～8/1,V/V) 纯化得白色固体5.7 g，产率72.1%;1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 8.65(d,J=2.4 Hz, 1H), 8.06～7.97(m, 2H), 7.80(d,J=2.1 Hz, 1H), 7.58(dd,J=8.4 Hz, 2.1 Hz, 1H), 7.52(d,J=8.4 Hz, 1H), 6.79(d,J=8.5 Hz, 1H), 5.90(s, 2H), 5.06(d,J=9.4 Hz, 1H), 0.93(s, 9H); MS(ESI)m/z: 395.2{[M+H]+}。

(7) 化合物8的合成[17-18]

称取化合物75.5 g(13.9 mmol)， CuI 264.7 mg(1.39 mmol)， NaI 5.2 g(34.8 mmol)，N,N-二甲基乙二胺245.1 mg(2.78 mmol)溶解于60 mL 二氧六环中，置换氮气3次后于110 ℃反应16 h。反应结束后，恢复至室温，抽滤，用50 mL乙酸乙酯洗涤，浓缩，残余物经硅胶柱层析(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯= 7/1～8/1,V/V)纯化得白色固体3.8 g，产率61.1%;1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 8.75(d,J=2.2 Hz, 1H), 8.14(dd,J=8.3 Hz, 2.2 Hz, 1H), 7.99(d,J=9.5 Hz, 1H), 7.79(d,J=2.0 Hz, 1H), 7.58(dd,J=8.5 Hz, 2.1 Hz, 1H), 7.39(d,J=8.3 Hz, 1H), 6.79(d,J=8.5 Hz, 1H), 5.90(s, 2H), 5.02(d,J=9.4 Hz, 1H), 0.93(s, 9H); MS(ESI)m/z: 444.1{[M+H]+}。

(8) 化合物9的合成[19-20]

称取化合物83.6 g(8.1 mmol)，T21.7 g(8.9 mmol)， CuI 380.6 mg(1.62 mmol)，碳酸铯6.7 g(20.25 mmol)，L1817.5 mg(4.86 mmol)溶解于50 mL DMF中，置换氮气3次后于 50 ℃反应12 h。反应结束后，过滤，收集滤液，直接进行下一步反应。

(9) 化合物10的合成

称取TBTU 7.7 g(24.1 mmol)和DIPEA 4.1 g(31.7 mmol)加入到上一步反应液中，缓慢滴加3.0 mL氨水(wt25%)反应12 h。反应结束后，溶解于150 mL乙酸乙酯中，分别用100 mL饱和食盐水、纯水洗涤，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，残余经硅胶柱层析(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯= 3/1,V/V) 纯化得棕褐色固体1.8 g，两步产率46.1%;1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 8.10(d,J=2.3 Hz, 1H), 7.92(d,J=8.8 Hz, 1H), 7.79(d,J=2.3 Hz, 1H), 7.62(dd,J=8.3 Hz, 2.0 Hz, 1H), 7.49(s, 2H),7.21(d,J=8.8 Hz, 1H), 6.93(dd,J=8.1 Hz, 2.4 Hz, 1H), 6.86(d,J=8.7 Hz, 1H), 5.94(s, 2H), 5.68(d,J=6.6 Hz, 1H), 4.91(d,J=7.8 Hz, 1H), 3.66(q,J=5.8 Hz, 1H), 2.62(dd,J=11.6 Hz, 5.2 Hz, 1H), 2.16(dd,J=11.7 Hz, 6.6 Hz, 1H), 1.26(s, 9H), 0.79(s, 9H); MS(ESI)m/z: 504.1{[M+H]+}。

表1 合成化合物5反应条件筛选

(10) 化合物11的合成[21-22]

称取化合物71.5 g(3.0 mmol)，吡啶791 mg(10 mmol)溶解于15 mL二氧六环中，冰浴下，缓慢滴加三氟乙酸酐1.25 g(6.0 mmol)，滴毕，恢复至室温，继续反应5 h。反应结束后，加入冰水淬灭反应，溶解于80 mL乙酸乙酯中，用水(2×50 mL)洗涤，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，残余经硅胶柱层析(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯= 5/1,V/V) 纯化得白色固体921.5 mg，产率64.3%;1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 7.91(d,J=2.8 Hz, 1H), 7.80(d,J=9.5 Hz, 1H), 7.74(d,J=2.0 Hz, 1H), 7.55(dd,J=8.5 Hz, 2.1 Hz, 1H), 7.11(d,J=8.4 Hz, 1H), 6.87(dd,J=8.4 Hz, 2.8 Hz, 1H), 6.79(d,J=8.4 Hz, 1H), 5.88(s, 2H), 5.56(d,J=6.1 Hz, 1H), 4.88(d,J=9.5 Hz, 1H), 3.68(q,J=6.2 Hz, 1H), 2.58(dd,J=14.6 Hz, 5.5 Hz, 1H), 2.28(dd,J=14.7 Hz, 6.9 Hz, 1H), 1.33(s, 9H), 0.88(s, 9H); MS(ESI)m/z: 486.3{[M+H]+}。

(11) 化合物12的合成[23]

称取化合物11900 mg(1.8 mmol)溶解于5 mL二氯甲烷中，缓慢滴加三氟乙酸5 mL，滴毕，继续反应3 h。反应结束后，浓缩，残余经液相色谱分离(洗脱剂：水/乙腈=3/1，V/V) 纯化得白色固体395.8 mg，产率51.1%;1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 8.17(d,J=2.7 Hz, 1H), 8.10(d,J=8.7 Hz, 1H), 7.80(d,J=2.1 Hz, 1H), 7.67(s, 1H), 7.58(dd,J=8.5 Hz, 2.0 Hz, 2H), 6.78(d,J=8.5 Hz, 1H), 5.06(d,J=8.7 Hz, 1H), 4.95(d,J=7.9 Hz, 1H), 3.82(s, 2H), 3.05(dd,J=16.9 Hz, 6.4 Hz, 1H), 2.93(dd,J=16.9 Hz, 7.4 Hz, 1H), 0.95(s, 9H);13C NMR(125 MHz, DMSO-d6)δ: 172.25, 170.60, 166.05, 148.17, 146.64, 143.11, 129.36, 128.26, 125.91, 122.24, 121.89, 119.54, 116.43, 114.49, 60.41, 41.40, 37.25, 35.63, 26.97, 26.97, 26.97; MS(ESI)m/z: 430.1{[M+H]+} 。

2 结果与讨论

2.1 合成

以2,5-二溴吡啶为原料合成化合物2，由于吡啶2-位溴的活性明显优于5-位，加入丁基锂后优先与2-位溴反应，实验表明，得到的化合物2中有85%以上化合物为2-位溴被取代的化合物，仅有少量5-位溴被取代的化合物，且两者极性有差异，经柱层析可将两者分离。在合成化合物6时，选用了不同的反应条件来合成[24-25]，结果见表1，反应条件1和2可直接将化合物3经过一步反应合成化合物6且产率均在86%以上，但合成的产物基本为外消旋体，后期进行手性拆分比较繁琐且收率较低。反应条件3虽然经过3步反应才合成化合物6，且产率也仅为60.3%，但是合成的产物中有94.5%的构型是所需要的，后期不需要进行手性拆分，节约了成本和时间，所以选取了反应条件3来合成。在合成化合物9时(表2)，起初以化合物7为底物，L1作为配体，用T2直接取代化合物7中吡啶5-位溴，经一步反应得到化合物9。但尝试了不同溶剂、不同反应温度及不同反应时间，均没有得到目标产物，原因可能是化合物7中吡啶5-位的溴反应活性较差。由于碘的反应活性强于溴，因此，考虑先将化合物7中吡啶5-位的溴替换为碘，然后再由T2将其取代，结果成功得到目标化合物9，并且尝试了不同的反应溶剂，发现溶剂为DMF时产率最高。

Scheme 3

Scheme 4

表2 合成化合物9反应条件筛选

2.2 反应机理

由化合物4合成化合物5时(Scheme 3)，首先化合物4中的氮与DIBAL-H中的铝配位(3-1)，由于化合物4含有手性且体积较大的叔丁基团，DIBAL-H有两个体积较大的二异丁基团，因此，受到空间位阻的影响，两者配位时只能从位阻较小侧配位，形成构型单一的配位化合物，同时，DIBAL-H中的氢只能从碳氮双键的单侧还原双键，随后，配位化合物结合溶剂中的质子(3-3)，DIBAL-H残基离去，因此可以得到构型单一的化合物5。

由化合物7合成化合物9反应过程比较复杂，提出了一个反应机理。在合成化合物8时(Scheme 4)，首先N,N-二甲基乙二胺作为配体与CuI络合，形成配体络合物；然后化合物7中溴存在孤对电子，配体络合物中铜存在空轨道，两者配位结合，同时，络合物中的碘进攻吡啶5-位，形成一个四元环的中间过渡态，最后，溴离子与配体络合物离去，碘取代吡啶5-位溴，这样就可以得到化合物8。

2.3 细胞活性

原代巨噬细胞(BMDM)在LPS+ATP的刺激下，活化的Caspase-1将关键促炎细胞因子IL-1β从无活性前体加工成熟，并促进其分泌，因此，Caspase-1被认为是炎症过程的关键介质，通过分析IL-1β的分泌量，可间接反映抑制剂对Caspase-1的抑制情况。因此，原代巨噬细胞(BMDM)在LPS+ATP的刺激下，分别加入不同浓度的化合物12，其中，LPS+ATP为空白对照组，ML132和Z-YVAD分别为两种10 nM和10 μM阳性参照，结果由图2可见，化合物12对Caspase-1的抑制活性随浓度的升高而逐渐增强。

图2化合物12细胞活性

3 结论

采用廉价易得的2,5-二溴吡啶为原料，经11步化反应合成了新结构的非肽类小分子化合物12，总收率为2.2%, 收率偏低，合成路线有待于进一步优化。采用ELISA法研究发现合成的化合物12对细胞(BMDM)的Caspase-1活性具有一定的抑制作用，但药物活性还有待进一步提高，为Caspase-1小分子抑制剂的研究提供了参考。