生物模板法合成三元硫化物及其抑菌活性

詹建波, 肖 果, 王 浩, 郑 晗, 余振华, 雷 涛, 余 娟, 王家强

(1. 云南中烟工业有限责任公司技术中心，云南 昆明 650231； 2. 云南大学 a. 教育部自然资源药物化学重点实验室， b. 云南大学国家光电子能源材料国际联合研究中心， c. 材料与能源学院， d. 化学科学与工程学院， 云南 昆明 650091)

无机抗菌材料具有广谱高效的杀菌性能、环境友好等优点，使其成为抗菌材料中的研究热点，如纳米银[1]、Ag/GO[2]、氧化石墨烯[3]等。而三元硫化物ABmCn[4]由于其在催化[5]、电化学[6]、生物医学[7]等方面的应用而备受关注。目前低毒甚至无毒的金属三元硫化物在抑菌领域的应用正在迅速兴起，特别是其广谱抑菌活性和低成本的获取方式吸引了人们的目光，如Cu2SnS3[8]和Cu2ZnSnS4[9]对革兰氏阳性和革兰氏阴性菌都有较好的抗菌活性；CdIn2S4对大肠杆菌具有良好的光催化灭菌活性[10]等。

合成金属硫化物有多种方法如水热/溶剂热[11]、微波辐射[12]、模板法[13]等。在众多方法中模板法是合成无机材料[14-16]的重要方法之一，通过加入不同的模板剂可以在材料合成过程中对其形貌、结构、排布等进行调控[17]，将纳米材料的合成引导为难以获得的形式。模板法中所用模板分为硬模板和软模板，其中软模板中生物模板法因其所具备的优良特点近年来被广泛用于材料的合成[18]。目前，已经将很多软模板(DNA[19]、谷胱甘肽[20]、木质素[21])用于制备新型纳米材料。三元硫化物的生物模板合成相比于化学合成来说在保证所合成的材料准确性的前提下可以降低合成成本，增强相应性能等优点，如以水生植物的叶片为模板合成ZnIn2S4用以提高其光催化产氢性能[22]，以L-半胱氨酸为模板制备硫化铋银(AgBiS2)可以降低污染物的排放及控制相应成本[23]，利用碳纤维的网状结构合成CuCo2S4纳米片用以增强对葡萄糖氧化的电催化特性[24]等。

基于生物模板在材料制备中的优点，以及其特殊的抑菌性能，利用天然易得的植物或植物提取物(如橡胶乳、大豆粉、三七粉、菠菜提取物、苝醌提取物等)为模板，采用溶剂热法制备了形貌各异的AgBiS2和Cu3BiS3材料，研究了其对枯草芽孢杆菌的抑制作用。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

TTR III D/max-3B型X射线衍射仪；Quanta 200 FEG型扫描电子显微镜；JEM-2100型透射电镜；Spectra max型酶标仪。

所用试剂均为分析纯。

1.2 合成

(1) 三元硫化物(AgBiS2和Cu3BiS3)的合成[13,25]

取0.85 g AgNO3(或2.42 g Cu(NO3)2·3H2O)和2.42 g Bi(NO3)3·3H2O 溶于30 mL的乙二醇中，同时，称取1.52 g的硫脲溶于20 mL乙二醇中，将该溶液加入到前者溶液中，持续搅拌30 min；分别将1.0 g的生物模板分散于10 mL的乙二醇溶剂中，将该模板溶液滴加至上述混合溶液中，持续搅拌3 h后，装入聚四氟乙烯反应釜内衬中，在200 ℃下反应24 h，反应后自然冷却至室温，分别用无水乙醇和蒸馏水将所得样品洗涤数次，90 ℃下干燥，得到黑色粉末材料为生物模板合成的AgBiS2或Cu3BiS3。

(2) 硫化铋(Bi2S3)的合成

称取2.42 g Bi(NO3)3·5H2O 或1.60 g BiCl3溶解在30 mL的乙二醇中；另称取1.52 g的硫脲溶解于20 mL的乙二醇中，在不断搅拌下，将两种溶液混合后搅拌3 h后，装入聚四氟乙烯反应釜内衬中，在180 ℃下反应24 h。反应后自然冷却至室温，分别用无水乙醇和蒸馏水将所得样品洗涤数次，于90 ℃下干燥，得到黑色粉末材料为Bi2S3。

1.3 抑菌性能

(1) 菌种及培养

以枯草芽孢杆菌为培养对象，该菌体是一种需氧的有柱状内芽孢的G菌，属于芽孢杆菌属，菌体为直杆状，0.5～2.0 μm，无荚膜，周生鞭毛，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5 μm，该菌种在30 ℃恒温箱中培养48 h后备用。

(2) 抑菌圈测定试验

将牛肉膏蛋白胨培养液和培养皿放于高压灭菌锅(压力为0.1～0.15 Mpa)中灭菌20 min，待培养基冷至适宜温度时，在超净工作台上，将培养基倒入灭菌的培养皿中，保证每皿10～20 mL培养基，并放于培养箱中，37 ℃恒温培养24 h。将500 μL配制好的悬菌液均匀涂布在培养基表面，然后加入沾有硫化物材料的圆纸片，将培养皿放入培养箱中，37 ℃恒温培养24 h。采用平板打孔法，利用打孔器将滤纸打成圆纸片(约6.0 mm)，将其浸泡在无菌液中制成抑菌片，同时，将滤纸片浸入无菌生理盐水，作为空白对照。取出抑菌片贴在含菌平板上，盖好平面皿，于37 ℃恒温培养箱，24 h后，测定产生的抑菌圈的直径，并对抑菌圈较大的材料进行TEM检测。

1.4 材料毒性

选取以苝醌提取物为模板制备的AgBiS2和Cu3BiS3为代表检测硫化物材料对正常细胞的毒性。将正常细胞小鼠胚胎成纤维细胞(BABL-3T3)分别接种于96孔板中培养24 h，同时设置空白与对照组，然后将不同浓度的硫化物材料加到孔板中，分别培养24 h和48 h后，向每个孔中加入50 μL MTT溶液，置于培养箱中培养4 h。取出孔板，将其中的培养基吸走，加入150 μL二甲基亚砜，振摇15 min后，通过酶标仪在490 nm处测量每孔的吸光度。

2 结果与讨论

2.1 XRD

(1) 不同生物模板AgBiS2的XRD

图1为分别以橡胶乳、大豆粉、三七粉、菠菜提取物、苝醌提取物为模板制备的硫化铋银材料的XRD。可以看到，在10°～70°的衍射范围内，5种不同的生物模板制备的AgBiS2样品呈现出了相似的XRD谱图。所有的衍射峰均可以归属于立方晶相[25]和六方晶[26]AgBiS2的衍射峰。

2/(°)

(2) 不同生物模板Cu3BiS3的XRD

图2是分别以橡胶乳、大豆粉、三七粉、菠菜提取物、苝醌提取物为模板制备的硫化铋铜材料的XRD。可以看到，在10°～70°的衍射范围内，5种不同的生物模板制备的Cu3BiS3材料表现非常相似的衍射图谱。所有的衍射峰均可以归属于斜方晶相Cu3BiS3[27]的衍射峰。

2/(°)

(3) 不同前驱体合成的Bi2S3的XRD

图3为不同前驱体制备的Bi2S3材料的XRD。可以看到，分别以Bi(NO3)3和BiCl3为前驱体制备的两种硫化铋材料均呈现了相同的衍射峰。所有的衍射峰均可以归属于斜方晶相Bi2S3的衍射峰[28]。

2/(°)

2.2 SEM

(1) 不同生物模板AgBiS2的SEM

图4为用扫描电镜观察下不同生物模板制备的AgBiS2样品的形貌SEM。可以看出，不同生物模板合成的AgBiS2形貌不一，颗粒大小不均一。使用大豆粉为模板合成的AgBiS2(图4a)，呈现颗粒状结构；使用苝醌提取物为模板合成的AgBiS2(图4b)，其结构呈现出雪花状；使用三七粉为模板合成的AgBiS2(图4c)，其结构为层状堆积的多角星形状；使用橡胶乳为模板合成的AgBiS2(图4d)，主要为颗粒状结构，同时伴有部分须状形貌的产生；以菠菜提取物为模板合成的AgBiS2(图4e)，其形貌为团聚的颗粒状结构。

图4(a)大豆粉；(b)苝醌提取物；(c)三七粉；(d)橡胶乳；(e)菠菜提取物为模板合成的AgBiS2的SEM图

(2) 不同生物模板Cu3BiS3的SEM

图5为用扫描电镜观察下不同生物模板制备的Cu3BiS3样品的形貌SEM图。以大豆模板合成材料的材料(图5a)，其形貌主要为表面不光滑的不规则球状结构；以三七粉为模板合成材料的形貌为由球状、棒状和少量块状组成结构(图5b)；以橡胶乳为模板合成的Cu3BiS3的形貌(图5c)也有多种结构(球状、片状和棒状)的存在；以菠菜提取物模板制备的材料(图5d)，其形貌主要呈现为片状、表面长有毛刺的球状和少量棒状结构 。

图5(a)大豆粉；(b)三七粉；(c)橡胶乳；(d)菠菜提取物为模板合成的Cu3BiS3的SEM图

(3) 不同前驱体合成的Bi2S3的SEM

图6是分别以硝酸铋(a和b)和氯化铋(c和d)为前驱体制备的硫化铋的SEM。根据XRD的结果，这两种前驱体均可以成功合成Bi2S3材料，但是其形貌却不同，以硝酸铋为前驱体合成的材料呈细长的棒结构，而以氯化铋为前驱体合成的材料为由短粗的棒状组成的球状结构。

图6不同前驱体(Bi(NO3)3 (a； b)和BiCl3 (c； d))合成的Bi2S3的SEM图

2.3 抑菌活性

表1总结出了Bi2S3和Co3+/Bi2S3以及不同生物模板合成的AgBiS2和Cu3BiS3材料的抑菌实验结果。其中Bi2S3和Co3+/Bi2S3均有抑菌圈的产生；对于AgBiS2材料，只有以苝醌提取物为模板的AgBiS2有抑菌圈产生；对于Cu3BiS3材料，5种生物模板合成的材料均有抑菌圈产生，其中苝醌提取物模板的Cu3BiS3产生的抑菌圈较大。

2.4 抑菌实验的TEM检测

图7为不同材料的抑菌作用的TEM，用戊二醛固定作用后的细菌，以便于观察。图7a是抑菌前的枯草芽孢杆菌的TEM，可以看到该细菌具有完整的细胞壁。图7b～7e分别为加入Bi2S3， Co3+/Bi2S3，苝醌提取物/Cu3BiS3和苝醌提取物/AgBiS2材料后抑制枯草芽孢杆菌生长的TEM。

表1 材料的抑菌效果

图7不同材料的抑菌作用的TEM图:(a)完整的枯草芽孢杆菌； (b)Bi2S3;(c)Co3+/Bi2S3；(d)苝醌提取物/Cu3BiS3； (e)苝醌提取物/AgBiS2

可以看出在加入棒状Bi2S3和雪花状苝醌提取物/AgBiS2抑菌材料后，细菌的芽孢壁开始收缩变形，表面开始出现凹凸不平的现象；而苝醌提取物/Cu3BiS3抑菌材料后，芽孢壁的一角已经破裂，同时伴有细胞质液体的流出，加入Co3+/Bi2S3抑菌材料后，细菌的芽孢壁完全破裂，已经无法观察到细菌原有的结构形貌。该结果与抑菌圈的实验结果相吻合，进一步表明，这些材料对枯草芽孢杆菌有较好的抑菌作用。

2.5 细胞毒性试验

通过MTT法测试了硫化物材料对正常细胞BABL-3T3的细胞毒性。测试结果表明：即使在浓度高达100 μg mL-1的情况下，用硫化物材料培养的BABL-3T3细胞的细胞存活率仍高于79%(表2)，表明该材料对于正常细胞的毒性很低甚至没有。

表2 细胞存活率

分别以橡胶乳、大豆粉、三七粉、菠菜提取物、苝醌提取物作为模板剂，采用溶剂热合成法，制备了具有不同形貌的三元硫化物(AgBiS2和Cu3BiS3)。通过平板抑菌实验和TEM表征检测了不同形貌材料对枯草芽孢杆菌的抑制作用，并利用MTT法测试了三元硫化物对正常细胞的毒性。实验结果表明：具有特殊形貌的Bi2S3(棒状)、苝醌提取物/AgBiS2(雪花状)、苝醌提取物/Cu3BiS3(棒状)等对该细菌表现出较好的抑菌作用，该材料对正常细胞BABL-3T3的影响很小甚至没有，这种特殊形貌材料的抑菌作用体现在抑菌过程的初始阶段，即利用其尖锐的结构刺破芽孢表面的细胞壁而进入细菌体内。同时，硫化物表面游离的金属离子通过静电作用进一步与芽孢内细胞膜表面的蛋白质基团结合，阻碍细菌进行正常的能量代谢，导致芽孢细菌死亡，最终起到抑菌作用。