基于网络药理学探讨当归-菟丝子治疗多囊卵巢综合征的作用靶标和信号通路

王翠翠，马晓欣

（中国医科大学附属盛京医院妇产科，沈阳 110022）

多囊卵巢综合征 （polycystic ovary syndrome，PCOS）是育龄期女性最常见的妇科内分泌疾病，通常表现为高雄激素血症和排卵障碍。其病因尚不明确，可能是遗传因素与环境因素共同作用的结果。临床上主要采取个性化的对症治疗，以达到满足生育要求、缓解临床症状的目的。从中医角度，PCOS辨证多为脏腑功能失调、痰淤阻滞、虚实夹杂，临床常见有肾虚、痰湿、气血淤滞、肝经郁热等类型，故现代医者多从肾、脾、肝论治PCOS，在调节脏腑功能同时，注重活血燥湿化痰，从而使气血正常运行，排卵如常，胞宫按时满溢［1］。借助中医传承辅助系统，得到治疗PCOS使用频率最高且药物组合频数最多的两味中药——当归和菟丝子［2］。当归味苦、温，无毒，首要功效是补气和血，最宜用于妇女月经不调。菟丝子甘、温，归肾、肝、脾经，具有滋补肝肾、固精缩尿、安胎、明目、止泻之功效。菟丝子还有雌激素样作用，可促进雌性动物卵巢和子宫发育，促进排卵［3］，具体机制尚不明确。网络药理学是基于系统生物学的理论，对药物的有效成分进行多靶点、多途径的生物系统网络分析。本文运用网络药理学方法筛选当归-菟丝子两味中药的活性成分，预测其与PCOS相关的靶标与信号通路，构建疾病-药物-成分-靶标的网络，分析当归-菟丝子治疗PCOS可能涉及的作用靶标和信号通路。

1 材料与方法

1.1 当归-菟丝子活性成分的获取

利用中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php） 检索当归和菟丝子两味药物所有的化学成分。根据药代动力学原理和平台推荐，在检索结果中限定口服生物利用度≥30%且类药性≥0.18，获得的化学成分作为当归和菟丝子两味中药的活性成分。

1.2 当归-菟丝子活性成分对应靶标的获取

再次利用TCMSP检索当归和菟丝子所有活性成分对应的靶标，并通过Uniprot数据库 （https：//www.uniprot.org） 获取候选靶标对应的基因ID。

1.3 PCOS疾病靶标的获取

分别检索GeneCards数据库 （https：//www.genecards.org） 和基因疾病关联数据库 （DisGeNET，http：//www.disgenet.org） 中与PCOS相关的靶基因，去重、合并，获得所有基因数据，将当归-菟丝子的活性成分对应的靶标与疾病的靶标共同映射绘制韦恩图，获得活性成分治疗PCOS的潜在作用靶标。

1.4 药物-成分-疾病靶标网络图构建

运用Cytoscape软件 （3.7.2版本） 将药物-成分-疾病靶标的网络关系可视化，以进一步了解当归和菟丝子两味中药的活性成分与治疗PCOS潜在作用靶标的对应关系。

1.5 靶标蛋白相互作用网络构建

将当归-菟丝子治疗PCOS潜在作用的靶蛋白导入蛋白质相互作用数据库 （STRING，https：//stringdb.org），限定物种为人，产生蛋白-蛋白相互作用网络，设置最小蛋白间相互作用分值为0.9，将结果以TSV格式导出，并利用R语言 （https：//www.r-project.org） 将每个潜在靶标的连接度进行排序，并以柱状图的形式列出前30位的关键靶标基因。

1.6 基因本体注释 （gene ontology，GO） 生物学过程及京都基因与基因组百科全书 （Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG） 通路分析

将当归和菟丝子治疗PCOS的潜在靶标基因ID导入DAVID数据库［4］（https：//david.ncifcrf.gov/summary.jsp），进行GO和KEGG代谢通路富集分析。选取满足校正后P＜ 0.05且Q＜ 0.05的生物学过程和通路，并根据校正后的P值升序排序，选取前20条，使用R语言绘制柱状图。

2 结果

2.1 当归-菟丝子的活性成分及对应靶标

从TCMSP中共获取当归的化学成分125种，菟丝子的化学成分29种。筛选出当归的活性成分2种，菟丝子的活性成分11种，重复1种，见表1。同时，在数据库中获取当归和菟丝子活性成分的对应候选靶标共375个，其中菟丝子活性成分sophranol未找到相应靶标，故当归-菟丝子关键有效的活性成分共11种。

2.2 当归-菟丝子的活性成分治疗PCOS的潜在作用靶标预测

在Uniprots数据库中输入靶标名称，获得375个候选靶标的相应基因。将其与GeneCards数据库和DisGeNET数据库检索到的与PCOS疾病有关的靶基因相映射，用韦恩图筛选出当归-菟丝子治疗PCOS的潜在作用靶标共135个。

2.3 当归、菟丝子-活性成分-潜在作用靶标网络构建

根据当归、菟丝子两味中药共包含的11种关键有效的活性成分，以及对应的135个与PCOS相关的潜在作用靶标，导入Cytoscape软件进行网络构建，并给予可视化展示。药物-活性成分-潜在作用靶标网络图共包括148个节点，其中当归-菟丝子的关键活性成分11种，与PCOS相关的135个潜在作用靶标形成382种对应关系，见图1。其中红色代表疾病PCOS，黄色代表当归-菟丝子，紫色代表两味中药中关键有效的活性成分，绿色代表两味中药与疾病有关的潜在作用靶标，相连的线表示两味中药与有效活性成分、有效活性成分与疾病靶标的对应关系。

表1 当归-菟丝子的活性成分Tab.1 Active ingredients in Angelicae Sinensis Radix-Cuscutae Semen

图1 当归-菟丝子的关键活性成分与疾病靶标的网络Fig.1 Network of the key active ingredients of Angelicae Sinensis Radix-Cuscutae Semen and the disease targets in PCOS

2.4 当归-菟丝子靶标蛋白相互作用网络

将当归-菟丝子中具有治疗PCOS作用的潜在作用靶标导入STRING数据库，从而获得蛋白质之间相互作用的网络图，共135个节点和418条边，结果以TSV文件导出，并利用R语言将每个靶标的邻接节点数进行统计排序，排名前30名的靶标用柱状图的形式进行可视化展示，见图2。其中AKT1的邻接节点为29个，JUN邻接节点为28个，MAPK1的邻接节点为26个，IL-6的邻接节点为20个，雌激素受体1 （estrogen receptor alpha，ESR1） 的邻接节点为19个。说明这几个基因可能在蛋白质互作网络中发挥重要的作用，是当归-菟丝子治疗PCOS的关键基因。

2.5 GO生物学过程富集分析

利用DAVID数据库对当归-菟丝子活性成分对应的潜在靶标进行生物学过程分析，见图3。P值越小，说明当归-菟丝子治疗PCOS涉及该生物学过程的可能性越大。条形图中，颜色越红，P值越小，说明富集越明显。

2.6 KEGG通路富集分析

再次利用DAVID数据库对当归-菟丝子活性成分对应的潜在靶标进行通路分析，见图4。条形图中，颜色越红，P值越小，富集越明显，说明此通路与治疗疾病的关系可能越大。

图2 当归-菟丝子治疗PCOS可能的关键基因Fig.2 Bar graph of the key targets of Angelicae Sinensis Radix-Cuscutae Semen in PCOS

图3 当归-菟丝子治疗PCOS潜在作用靶标的GO富集Fig.3 GO enrichment of the potential treatment targets of Angelicae Sinensis Radix-Cuscutae Semen

3 讨论

PCOS为妇科内分泌常见疾病，中医常以当归-菟丝子作为补肾活血药方之一用于治疗PCOS［5］。本研究利用数据库筛选出当归-菟丝子中11种有效活性成分，其中研究最多的是槲皮素。有研究［6］表明，与安慰剂组相比，槲皮素可增加PCOS患者血清脂联素水平，降低血糖、胰岛素、胆固醇和甘油三酯水平，降低体内雄激素和黄体生成素水平，改善脂联素介导的胰岛素抵抗和异常的激素水平。在脱氢表雄酮诱导的PCOS小鼠模型中，有学者发现槲皮素可显著降低小鼠体质量，减小卵巢体积，改善PCOS小鼠的胰岛素抵抗状态，降低肝脏葡萄糖激酶和己糖激酶的特异性活性，明显增加PCOS小鼠ERα和GLUT4基因表达水平，预示槲皮素可能是治疗PCOS胰岛素抵抗和不孕的理想化合物［7］。

图4 当归-菟丝子治疗PCOS潜在作用靶标的KEGG富集通路Fig.4 KEGG pathway analysis of the potential treatment targets of Angelicae Sinensis Radix-Cuscutae Semen

根据靶点预测技术，预测出当归-菟丝子治疗PCOS潜在的作用靶点共135个，利用蛋白相互作用网络，分析其中可能的关键靶标有AKT1、JUN、MAPK1、IL-6和ESR1等。蛋白激酶B即AKT与雄激素之间可形成正反馈，在颗粒黄体细胞增殖和卵泡生长方面具有重要的作用。有研究［8］发现，高雄激素型PCOS患者颗粒黄体细胞中雄激素、AKT1、AKT2的表达增高，说明AKT1和AKT2高表达可能是高雄激素血症型PCOS患者颗粒黄体细胞功能异常的原因之一。有学者利用基因芯片技术筛选出PCOS差异基因，通过拓扑和功能富集分析，构建转录因子-microRNA协同调节网络，发现转录因子SP1与miR-355-5p可能共同作用于靶基因JUN，参与Wnt信号通路、转化生长因子-β信号通路和细胞周期的调控，在PCOS的发生、发展中发挥重要的作用［9］。MAPK可能参与调节细胞的生长、分化、对环境的应激适应、炎症反应等多红细胞生理和病理过程。研究［10］发现，用二甲双胍和氟他胺治疗PCOS小鼠，可上调肝脏和肠管的胰岛素信号通路，包括胰岛素受体、MAPK1和AKT2等，从而改善PCOS小鼠胰岛素抵抗的状态。IL-6是活化的T细胞和成纤维细胞产生的淋巴因子，IL-6可以调节C反应蛋白转录水平，两者联合可以预测PCOS患者发生2型糖尿病和心血管疾病的风险［11］。ESR1编码雌激素受体，可能与雌激素受体2形成同型二聚体或异型二聚体，影响靶组织中的细胞增殖和分化。PCOS患者常因为子宫内膜功能异常，造成生育力降低。有学者发现，来曲唑可增加ESR1的表达，通过Wnt/β-catenin通路，增加子宫内膜厚度，提高PCOS患者的妊娠率［12］。

GO注释结果显示，当归-菟丝子的135个潜在作用靶标主要富集在核受体活性、转录因子活性调节序列特异性DNA结合、类固醇激素受体活性、细胞因子受体结合、蛋白质异源二聚体活性、类固醇结合及近端启动子序列特异性DNA结合等，KEGG的富集通路主要在糖尿病并发症AGE-RAGE信号通路、液体剪切应力、动脉粥样硬化和内分泌抵抗等。解释了PCOS以胰岛素抵抗为特征以及远期易出现2型糖尿病和心血管疾病的可能原因。

综上所述，本研究表明，当归-菟丝子治疗PCOS的活性成分可能为槲皮素、谷固醇、山柰酚、芝麻素和异鼠李素等11种化合物，这些活性成分可能通过AKT1、MAPK1、IL-6和ESR1等靶标作用于糖尿病并发症AGE-RAGE信号通路、液体剪切应力、动脉粥样硬化和内分泌抵抗等信号通路，发挥治疗作用。但是，本研究仅在分子水平初步预测当归-菟丝子治疗PCOS可能涉及的信号通路，今后仍需要更多的研究以进一步阐明其作用机制。