DNA损伤修复通路因子53BP1在骨髓干细胞自我更新和分化发育中的作用

尤放，王美莲

（中国医科大学基础医学院病原生物学教研室，沈阳 110122）

维持基因组序列信息的完整性对于生物体的存在至关重要，细胞应对各种类型损伤因子所导致的DNA损伤主要是通过激活复杂而精细的DNA损伤应答 （DNA damage response，DDR） 通路［1］。具有细胞毒性的双链断裂损伤 （double strand breaks，DSBs） 是最为严重的DNA损伤形式之一，未得到正确处理的DSBs除可增加细胞的致死率外，还会增加癌症的易感性［2］。53BP1（P53 binding protein 1） 是一种蛋白质编码基因，在DSBs损伤相关信号转导通路中扮演极其重要的角色，主要参与并影响DSBs的修复决策［3］。53BP1是脊椎动物芽殖酵母Rad9和裂殖酵母Crb2/Rhp9检查点蛋白的直系同源蛋白。作为进化保守的DNA损伤检查点蛋白家族的一员，53BP1与p53结合可调节细胞周期进程和细胞增殖［4］。DSBs发生后，因损伤周围的染色质性质发生变化，高度磷酸化的53BP1迅速聚集于断裂位点。53BP1通过调控DNA末端处理方式及DSBs的动力学过程来避免产生突变修复的结果［5］。

近年来，对53BP1相关功能的探索一直是国内外科研领域的研究热点，53BP1与诸多体内生理反应间均存在联系，本研究拟探讨53BP1对骨髓干细胞 （bone marrow stem cell，BMSC） 自我更新及分化的影响，从干性细胞周期检查点入手，着眼于53BP1对BMSC数量和质量的控制，重点研究53BP1与BMSC自我更新及分化过程的内在联系。

1 材料与方法

1.1 动物、细胞及主要试剂

C56/7小鼠购自辽宁长生生物技术有限公 司，C2C12细胞由本实验室保存，ProCount Progenitor Cell Enumeration Kit （美国BD公司），HRPlabeled Goat Anti-Mouse IgG （H+L）（北京鼎国生物技术有限公司），Anti-53BP1抗体（美国Novus Biologicals公司），Anti-Mouse-CD117 （c-Kit） PE抗体（美国PeproTech公司），Anti-Mouse-Ly6A/E （Sca-1） -Biotin抗体（英国Abcam公司），Lineage Cell Dection Cocktail-Biotin，Mouse组合抗体 （德国Miltenyi Biotec公司），FITC anti-mouse CD4 和粒系分化抗原-1 （granulocyte differentiation antigen-1，Gr-1）单克隆抗体 （美国Lsbio公司）。

1.2 构建53BP1全身敲除小鼠模型

以小鼠53BP1的cDNA片段为探针从129小鼠基因组DNA噬菌体文库中分离出53BP1小鼠基因组DNA，克隆至 pZErO-2质粒，通过将外显子替换构建靶向载体，线性化后电转入129/Sv小鼠的胚胎干细胞 （embryonic stem cells，ESCs） 中。利用分子杂交筛选出约200个G418抗性ES克隆。靶向注射获得嵌合体小鼠后同C57/6小鼠杂交，成功杂交鼠将用于获得53BP1-/-小鼠。此外，选取3 d的胚胎独立培养，并严格按照国际标准程序建立胚胎细胞系。

1.3 细胞分选及其表面分子标记检测

1.3.1 小鼠骨髓细胞的分离和计数：麻醉后处死小鼠，消毒后分离双侧股骨和左右胫骨，小心剔除软组织，抽取2 mL的缓冲液彻底冲洗骨髓腔，获得骨髓血后，使用滤器及筛网过滤，胰蛋白酶消化30 min，加入2 mL的伊斯科夫改良的杜贝克培养基（Iscove’s modified Dubecco’s medium，IMDM） 1 000 r/min离心5 min，制备单细胞悬液，基于2个胫骨和2个股骨包含小鼠体内所有骨髓细胞25%的假设，通过细胞分析仪进行计数。

1.3.2 细胞分选：使用2 mL IMDM冲洗骨髓细胞，加入Gey’s Lysis Buffer，冰上孵育10 min。用预混的抗体混合物于冰上标记30 min，加入1 ∶100稀释的链霉亲和素结合的量子红 （streptavidin-conjugated quantum red，SAQR） 试剂，免疫染色30 min。流式细胞分选仪进行分选，每个样本取40×106进行染色分选，流速控制为约200/s，分选纯度≥97%。

1.3.3 细胞表面分子标记检测：收集待染细胞，进行染色和固定，上机检测，打印本次实验分析报告。

1.4 细胞培养及诱导分化

C2C12细胞培养于杜贝克改良培养基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM），放置于CO2振荡孵箱中培养。诱导分化培养基由添加2%马血清的DMEM组成，当细胞融合率达90%，更换为分化培养基 （differentiation medium，DM）。分选获得的KSL细胞培养于IMDM，需向其中添加相应细胞因子混合物。

粒细胞-巨噬细胞集落形成单位 （granulocytemacrophage colony forming unit，CFU-GM） 体外检测跟据加拿大STEMCELL Technologies公司的生产商指示说明进行操作。培养5～7 d后，评估菌落形成的数量。

1.5 53BP1表达检测

1.5.1 DAPI荧光染色观察53BP1表达情况：细胞预处理，使用预冷的甲醇固定，Triton X-100透膜，PBS清洗，DAPI染色，封片，荧光显微镜下观察并拍照留存。

1.5.2 Western blotting检测53BP1蛋白的表达含量：提取细胞总蛋白，并进行蛋白质浓度测定，RIPA稀释后，取样进行SDS-PAGE电泳，转膜，封闭，抗体杂交，ECL化学发光。

1.6 Co-IP检测磷酸化修饰蛋白

免疫共沉淀 （co-immunoprecipitation，Co-IP）：加入750 μL细胞裂解液，用细胞刮刀刮取细胞，转移至EP管中，冰上裂解30 min，每间隔10 min，使用涡旋仪混合5 s，4 ℃，13 000 r/min离心10 min，吸取上清，4 ℃过夜；次日，涡旋磁珠5 min，取30 μL重悬的磁珠，PBS洗涤，于磁力架上进行磁性分离；加入500 μL预先稀释的相应抗体，孵育15 min，每间隔5 min使用涡旋混匀器5 s，磁性分离后收集磁珠，变性洗脱，吸取上清，煮样5 min进行SDS-PAGE电泳。

1.7 统计学分析

收集相关数据，分对照组 （WT） 和实验组 （Mut）2组。采用SPSS 22.0进行统计学分析，计量资料以表示，采用双侧t检验进行比较，Graphpad Prism 8.0制图，P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 53BP1对小鼠胚胎形成和细胞分化的影响

伴随小鼠胚胎不断发育形成，53BP1表达呈下降趋势，12 d可见WT组53BP1大量表达，Mut组无表达，16 d观察到WT组53BP1表达显著减少，Mut组无表达，18 d 2组均未观察到53BP1表达，见图1A。伴随ESCs、KSL细胞和C2C12细胞分化发育过程进行，53BP1表达呈上升趋势，表达量均显著增加。24 h见53BP1微量表达，48 h后53BP1表达增加，主要位于细胞质中，72 h观察见53BP1逐渐由胞质向细胞核扩散，最终大量弥散表达于所有ESCs中，见图1B。伴随KSL细胞分化进行，53BP1表达递增，5 d 2组均未观察到53BP1的表达，10 d可见WT组53BP1在KSL细胞中大量表达，Mut组无表达，见图1C。就C2C12细胞而言，1 d未观察到53BP1的表达，4 d可见53BP1的表达量显著增加，见图1D。以上结果表明53BP1主要作用于小鼠胚胎形成早期，伴随ESCs、C2C12细胞及KSL细胞的分化进行，53BP1表达量显著增加，证实了53BP1参与BMSC的分化发育过程。

2.2 53BP1对KSL细胞总数、细胞周期及表面分子标记的影响

结果显示，53BP1参与并影响KSL细胞的自我更新过程，53BP1基因敲除可影响KSL细胞分化过程中表面分子标记的表达。53BP1基因敲除使得KSL细胞总数较之于WT组显著减少，WT组KSL细胞数量为0.093±0.010，Mut组KSL细胞数量为0.033±0.006，差异有统计学意义 （P=0.003），见图2A。53BP1基因敲除与否并不显著影响处于细胞周期静息期 （G0期） 及细胞间期 （G1期） 的KSL细胞百分含量，G0期WT组KSL细胞百分含量为88.333±5.774，Mut组KSL细胞百分含量为86.667±3.055，差异无统计学意义 （P=0.681）；G1期WT组KSL细胞百分含量为11.667±5.774，Mut组KSL细胞百分含 量为13.333±3.055，差异无统计学意义 （P=0.681），见图2B。53BP1基因敲除使得KSL细胞表面干性分子标记CD34+表达较之于WT组显著减少，WT组CD34+KSL细胞数量为0.073±0.014，Mut组CD34+KSL细胞数量为0.013±0.007，差异有统计学意义 （P=0.007），见图2C。53BP1基因敲除与否并不显著影响KSL细胞表面标记CD34-的表达，WT组CD34-KSL细胞数量为0.021±0.001，Mut组CD34-KSL细胞数量为0.020±0.003，差异无统计学意义（P=0.789），见图2D。53BP1基因敲除与否并不显著影响体外培养的KSL细胞的生长速率，差异无统计学意义 （P=0.742），见图2E。53BP1基因敲除使得体外培养的KSL细胞伴随分化进行，其表面分子标记Mar/Gr-1+百分含量显著增加，WT组Mar/Gr-1+相对百分含量为24.250±5.737，Mut组Mar/Gr-1+相对百分含量为49.250±12.580，差异有统计学意义 （P=0.011），见图2F；53BP1基因敲除使得KSL细胞表面标记CD45+表达则明显减少，WT组CD45+KSL细胞数量为34.500±4.796，Mut组CD45+KSL细胞数量为15.750±4.349，差异有统计学意义 （P=0.001），见图2G。

2.3 53BP1对PBL细胞定向分化的影响

53BP1基因敲除使得外周血淋巴细胞 （peripheral blood lymphocytes，PBL） 定向分化产生的单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞较WT组均显著增加，差异有统计学意义 （P分别为＜0.001、0.004和0.002）。结果显示，53BP1可影响BMSC的分化发育过程，53BP1基因敲除可使定向分化产生的单核细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞细胞显著增加。见图3。

2.4 53BP1对磷酸化修饰蛋白表达的影响

53BP1基因敲除可显著影响磷酸化修饰蛋白p-H4 （k20）、p-H3 （k79）、p-ATM和p-53-Ser20的表达水平。53BP1基因敲除上调了p-H4 （k20） 和p-H3 （k79）2种磷酸化修饰蛋白的表达水平，WT组未观察到上述2种蛋白的表达；此外，53BP1基因敲除导致p-ATM和p-53-Ser20蛋白表达显著减少，见图4。

3 讨论

图4 53BP1对磷酸化修饰蛋白表达的影响 ×200Fig.4 Effect of 53BP1 on the expression of phosphorylated proteins ×200

ESCs具有较高的同组重组 （homologous recombination，HR） 发生频率，并伴有DSBs修复。延迟ESCs中细胞周期G1/S的转变可形成含有53BP1的核小体，并抑制ssDNA的堆积［6］。C2C12细胞作为经典成体干细胞模型，来源于小鼠成肌细胞株的亚克隆，在体外经诱导分化，可形成富含蛋白质的多核肌管［7］。造血干细胞 （hematopoietic stem cells，HSCs） 缺乏成熟血细胞标志物的表达，不表达Lin家族蛋白，故被称为Lin-细胞。c-kit的表达是HSCs的主要表型特征，作为受体与其配体干细胞因子 （stem cell factor，SCF）的相互作用可触发一系列信号转导事件。小鼠骨髓中的KSL细胞，即表达c-kit和Sca-1的Lin-细胞群，具有极强的多向分化潜能和自我更新能力，可在体外培养条件下进行细胞增殖及分化［8］。伴随ESCs、C2C12细胞和KSL细胞分化的进行，53BP1表达量均显著增加，这证实了本研究关于53BP1可影响BMSC分化发育过程的推测。

CD34+可广泛高水平表达于早期造血干/祖细胞，随着细胞不断成熟，其表达则呈进化性下降，乃至最终消失，可作为多能干细胞向髓系定向分化的标志［9］。经γ射线辐射诱导后CD34+的HSCs相比于成熟淋巴细胞，53BP1蛋白的招募水平提升，DNA修复能力亦随之增强［10］。Gr-1高水平表达于中性粒细胞表面，亦可表达于记忆型T细胞以及树突状细胞的表面。肿瘤浸润的Gr-1+骨髓细胞可拮抗衰老［11］。CD45分子可选择性表达于除红细胞、血小板和浆细胞以外的所有造血细胞表面。髓系细胞的成熟度和分化程度越高，其表达CD45分子量相应也越多［12］。53BP1基因敲除使得KSL细胞表面标记Mar/Gr-1+百分含量显著增加，而CD34+和CD45+分子标记表达则明显减少，提示53BP1参与并影响KSL细胞的自我更新及分化发育过程，53BP1基因敲除可影响KSL细胞表面分子标记的表达。

细胞周期静息期 （G0期） 细胞随暂时停止分裂活动但仍保存相应潜力，受刺激后亦可继续进行增殖，而细胞间期 （G1期） 则作为细胞周期调节主要阶段，其阻留决定了细胞周期的进展方向。53BP1基因敲除与否并不显著影响处于细胞周期G0/G1的KSL细胞百分含量。53BP1基因敲除后，发现KSL细胞的生长曲线较之于WT组稍有下降，但并不显著。

p-H4 （k20） 可伴随有丝分裂细胞周期的进展显著增加，p-H3 （k79） 同信号转导和基因转录密切相关［13］。p-ATM在DNA修复的激活、多种致癌途径以及基因组完整性的维持中起扮演关键角色［14］。p-53-Ser20的存在对细胞生长具有抑制作用［15］。本研究发现53BP1基因敲除后p-H4 （k20） 和p-H3 （k79）含量显著增多，但p-ATM和p-53-Ser20显著减少，据此推测53BP1可影响这4种磷酸化蛋白的表达水平，进而影响BMSC的自我更新和分化发育过程。

综上，DNA损伤通路因子53BP1参与并影响BMSC的自我更新及定向分化过程，这一结论将为日后对于53BP1功能更为深入的探索提供新的理论基础与支撑，使其进入更加广阔的研究领域。