泛发性雀斑样痣三例SASH1基因突变研究

张天骄，杨秀敏，魏爱华

泛发性雀斑样痣（generalized lentiginosis，GL）是一种罕见的色素障碍性皮肤病，多呈常染色体显性遗传。临床表现为婴幼儿时期即出现的大量棕褐至黑褐色色素沉着斑，以日光暴露区域为著，可累及口腔黏膜、外阴黏膜和掌跖等部位，部分患者可并发心血管疾病、神经性耳聋、智力低下、性腺发育不全、骨骼发育异常、身材矮小等系统性疾病。目前已报道PTPN1、BRAF、RAF1及SASH1基因的变异与GL的发病相关[1]。本研究收集了3例临床诊断为GL的患者，为明确诊断并提供遗传咨询，通过全外显子测序的方法，对该3例患者进行了基因检测和遗传学分析。

1 材料和方法

1.1 临床资料

先证者1，男，9岁。全身皮肤色素沉着斑8年余。患儿出生3个月后，面颈部出现粟粒至黄豆粒大小的褐色斑疹，无痛痒等自觉症状，渐延及躯干、四肢。患儿智力正常，生长发育良好，系统查体及多种辅助检查均未见异常。否认家族类似疾病史及近亲婚育史。皮肤科查体：面颈部、躯干及四肢散在粟粒至蚕豆粒大小的棕褐色斑疹，以曝光部位为著，掌跖及口腔黏膜未见累及（图1a）。

先证者2，男，8岁。全身皮肤色素沉着斑7年余。患儿出生6个月后，面部出现粟粒至绿豆粒大小的褐色斑疹，颜色深浅不一，渐延及躯干、四肢。近1年，面部皮损部分消退。患儿智力正常，生长发育良好，系统查体及辅助检查均未见异常。否认家族史及家族近亲婚育史。皮肤科查体：面颈部、躯干及四肢弥散粟粒至绿豆粒大小的浅褐色至黑褐色斑疹，以曝光部位为著，掌跖及口腔黏膜未见累及（图1b）。

先证者3，女，6岁。全身皮肤色素沉着斑5年余。患儿出生6个月后，面部及双上肢曝光部位出现粟粒至黄豆粒大小的棕褐色斑疹，圆形或椭圆形，渐延及颈部、躯干及双下肢。患儿智力正常，生长发育良好，系统查体及辅助检查均未见异常。否认家族类似疾病史及近亲婚育史。皮肤科查体：面部、四肢弥漫粟粒至黄豆大小棕褐色斑疹，部分融合成片；躯干部亦可见散在分布的少量类似皮损（图1c）。

图1 泛发性雀斑样痣患儿临床皮损表现

3位先证者的监护人均拒绝皮肤组织病理检查，故无相关组织病理检查资料。

1.2 方法

1.2.1 外周血DNA提取 由监护人签署知情同意后，分别采集3例先证者及其父母外周血各2 ml，采用磁珠法通用型DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）提取外周血基因组DNA。

1.2.2 全外显子组测序 先证者DNA样品通过Covaris破碎仪随机打断成长度为180-～80 bp的片段并制备文库，利用Agilent SureSelect Human All Exon V6试剂盒对目标区域进行捕获，Illumina高通量测序平台对变异进行检测。

1.2.3 Sanger测序 Sanger测序验证高通量测序结果，并对其父母行家系内验证，确定变异的亲本来源。

1.2.4 生物信息学分析 对测序数据进行生物信息学分析，以GRCh37/UCSC hg19作为参考基因组进行比对，依据严格的筛选标准对变异进行过滤，并添加人类基因组突变频率数据库（Genome Aggregation Database, gnomAD）东亚人群、千人基因组数据库（1000 Genomes Project）、RefSeq参考序列数据库、人类基因突变数据库（the Human Gene Database,HGMD）、在线人类孟德尔遗传数据库（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）以及蛋白功能预测软件等相关注释信息。对于未见文献报道及数据库收录的新变异，根据美国医学遗传学与基因组学学会（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）发布的《序列变异解读的标准和指南》，对变异进行致病性分级。

2 结果

在3例先证者SASH1基因上检出3种杂合变异，根据ACMG指南，分级为致病性变异和可能致病性变异，未发现PTPN11，RAF，BRAF，PTEN，LKB1等文献报道的其他可伴有雀斑样痣表现的基因变异。结合临床表型和分子诊断，3例先证者均确诊为泛发性雀斑样痣。

先证者1. 检出SASH1基因c.1526_1527insAAGT（p.Leu511Lysfs*21）杂合移码变异，先证者父母（通过亲子鉴定）均未携带，考虑为de novo变异（不排除生殖系嵌合等可能）。此变异在gnomAD东亚人群及1000 Genomes中国人群中均未收录，在HGMD数据库中为已报道的致病性突变。根据ACMG指南，该变异分级为致病（PS2+PS4）（表1，图2）。

先证者2. 检出SASH1基因c.1520C＞T（p.Ser507Phe）杂合错义变异，先证者父母（通过亲子鉴定）均无携带，考虑de novo变异（不排除生殖系嵌合等可能）。该变异尚无文献报道，在gnomAD东亚人群、1000 Genomes中国人群及HGMD中国人群中均无收录，生物信息分析软件SIFT、Mutation_Taster和PolyPhen2均预测有害。根据ACMG指南，c.1520C＞T（p.Ser507Phe）分级为可能致病（PS2+PM2+PP2+PP3+PP4）（表1，图2）。

表1 3例先证者基因检测结果

图2 3例先证者家系图及家系SASH1基因Sanger测序验证结果

先证者3. 检出SASH1基因c.1761C＞G（p.Ser587Arg）杂合错义变异，母亲未携带（父亲已故）。该变异已有文献报道[2,3]，但gnomAD东亚人群、1000 Genomes中国人群和HGMD中国人群中目前均无收录。该变异在SASH1基因高度保守的SH3功能域上，Clinvar收录该区域的错义突变为致病变异。已有功能研究证实，该变异可引起SASH1蛋白表达量显著降低[3]。生物信息分析软件SIFT、Mutation_Taster和PolyPhen2均预测有害。根据ACMG指南，该变异分级为致病（PS3+PM1+PM2+PP2+PP3+PP4）（表1，图2）。

3 讨论

GL是一种以幼年时期迅速出现的大量黑褐色斑疹为主要特征的色素障碍性皮肤病[4,5]。根据有无系统受累，分为发疹性黑子病（eruptive lentiginosis）和泛发性黑子综合征（multiple lentigines syndrome）。前者表现为仅累及皮肤的损害，后者除典型的皮肤表现外，可并发眼距增宽、内眦赘皮、上睑下垂等特殊面容及心血管、呼吸、神经、骨骼，泌尿生殖等全身系统的异常。

据文献报道，超过90%的泛发性黑子综合征的发生与PTPN11、BRAF及RAF1基因突变相关[6]，而发疹性黑子病基因研究相对较少。2015年，Shellman等[7]将发疹性黑子病的致病基因定位于SASH1基因。SASH1基因定位于染色体6q24.3区域，共包含22个外显子，其编码蛋白是由l 247个氨基酸组成的SLY家族的信号衔接蛋白，包含1个高度保守的功能域，1个SH3功能域和2个SAM功能域。研究证实，该基因的突变与人类的异常皮肤色素沉着有关。Shellman等[7]发现，突变的SASH1蛋白通过增加与Gαs亚基和IQ功能域GTP酶激活蛋白1（IQGAP1）的结合导致E钙黏素表达减少，引起GL发病过程中黑素细胞特定的迁移和分布。在一项最新的研究中，Cui等[3]发现SASH1突变可通过抑制SASH1-TGF-β1信号途径，导致表皮中黑素细胞的形态和定位异常，从而引起异常的色素沉着。

迄今，仅在4例诊断为发疹性黑子病的患者中检测到了SASH1变异[4,7,8]，而在泛发性黑子综合征型的患者中尚未发现该基因上的变异。值得注意的是，SASH1基因变异导致的色素异常表型具有异质性，可与其他临床综合征发生重叠。基因突变位点不同，表型可不同。例如，SASH1基因变异也可致遗传性泛发性色素异常症（dyschromatosis universalis hereditarian，DUH）。DUH是一种常染色体显性遗传病，常表现为不同程度的色素沉着与色素减退斑相互间杂，呈现斑驳样外观，皮损常均匀泛发全身而与日光暴露无关。皮损的形态和颜色不随年龄增长和季节变化而改变。本研究中的3例先证者均表现为以曝光部位为主的雀斑样斑疹，全身未见类似DUH的色素减退斑。先证者2面部皮损随着年龄增长有部分消退。对比既往报道的DUH患者的表型，结合基因检测结果，本研究3例先证者均诊断为泛发性雀斑样痣。3例先证者均未发现皮肤以外的系统病变，推测原因可能为：①均属于发疹性黑子病；②GL的皮损常发生在幼年，系统性病变多发生于成年以后或者更晚，3例患儿均还未到系统性损害的发病年龄。目前尚无确切方法早期区分发疹性黑子和泛发性黑子综合征。GL的早期确诊，有利于检测可能出现的系统病变并及时干预。笔者将对这3例患儿进行长期的随访观察。

目前文献共报道了11种SASH1基因变异与色素异常性皮肤病的发生相关。其中，SASH1基因p.S507A,p.S513R,p.S519N和c.1527_1530dupAAGT变异与GL表型相关[4,7,8]，涉及4例患者。这些患者均表现为以曝光部位为主的散在或密集分布的黑褐色斑疹，仅有1例患者伴有少量散在的色素减退斑[4]。SASH1基因p.S587R，p.E509K，p.L515P，p.Y551H，p.Y551D和p.M595T变异与DUH的发生相关[2,9,10]，患者均表现为全身泛发的不规则色素沉着斑，夹杂均匀分布的色素减退斑，呈网状或斑驳样外观。SASH1基因纯合变异p.E617K可导致以色素异常、掌跖角化、复发性鳞状细胞癌和斑秃为表现的临床综合征[11]。

本研究中，先证者1检出的SASH1基因c.1526_1527dupAAGT变异，曾在1例临床诊断为GL的中国患者中检出。该患者与本研究中的3例患者具有相似的临床表型[4]。先证者2检出的SASH1基因p.S507F变异，目前尚无文献报道与数据库收录，但在相同氨基酸位置的p.S507A变异曾在1例表现为GL的中国患者中检出[8]。先证者3检出的SASH1基因p.S587R变异已有文献报道，在两个不同研究中的中国DUH家系中，患者均检出了此变异[2,3]。本研究为首次报道该变异可致GL表型，进一步证实了SASH1基因变异所致的临床表型具有异质性。

本研究通过全外显子组测序结合生物信息学分析的方法，确诊了3例GL散发病例，鉴定出SASH1基因的3种变异，进一步证实了SASH1是导致雀斑样痣表型伴或不伴色素异常症的致病基因[4,5]。新变异的鉴定，丰富了人类基因突变数据库，为泛发性雀斑样痣的遗传咨询提供了有益信息。