娄水珠,朱娅宁,马肖燕,李文义,杜刚,杨海英,汪伟光
(1.云南民族大学 化学与环境学院,云南 昆明 650500;2.云南民族大学 民族药资源化学国家民族事务委员会-教育部重点实验室,云南 昆明 650500)
植物内生真菌是指存活于健康植物组织中,却不会使宿主植物表现出明显感染症状的微生物[1],它是植物微生态系统的重要组成部分.宿主植物与内生真菌长期协同进化,互利共生[2],使得内生真菌往往可以产生结构丰富的次生代谢产物.研究发现,在实验培养条件下,内生真菌微生物天然产物代谢途径的很多基因或基因簇都是沉默的.因此,激活这些沉默基因或基因簇将有可能产生新的天然产物.如何激活植物内生真菌中沉默的天然产物生物合成基因或基因簇成为当下研究的热点问题[3].
利用化学表观遗传学方法来发现新天然产物是一种有效的策略,其机制主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA等[4].其中,组蛋白去乙酰化酶抑制能够使组蛋白去乙酰化、染色质卷缩,抑制转录,沉默基因,抑制细胞内多种信号通路、凋亡相关基因以及细胞黏附转移相关基因表达,激活沉默基因[5],代表修饰剂有伏立诺他、帕比司他、恩替诺特和西达本胺等.研究表明,通过化学表观遗传修饰,可以改变真菌次级代谢的分子机制,达到基因沉默或基因表达的目的[6-7].Cichewicz课题组于2008年最先提出运用化学表观遗传修饰剂来抑制真菌中影响表观遗传的酶类激活一些沉默基因的表达,从而诱导真菌能产生未知的次级代谢产物,并且分离得到结构新颖的骨架[8].2011年Asai对2株昆虫内生真菌Torrubiellaluteorostrata和Cordycepsannullata进行了化学表观遗传修饰剂作用下的研究,得到3个结构新颖的新化合物色氨酸异戊二烯类化合物[9].2013年Asai研究组在对1株由芍药的叶片中分离得到的植物内生真菌Graphiopaischlorocephala的研究中,在其培养基中添加烟酰胺进行发酵,最终从发酵产物中分离鉴定了3个二苯甲酮类化合物[10],该系列化合物均具有新颖的化学结构.本课题组前期也从滇重楼内生真菌分离得到Phomopsissp. 0391对其进行组蛋白脱乙酰酶抑制剂诱导,得到新化合物13-angeloyloxy-diplosporin[11]以及杂色曲霉Aspergillusversicolor0312中的过表达产生新的化合物versicolor A.
本文对采自云南省呈贡区的野生重楼样品中的1株菌寄生属 (Hypomyces) 内生真菌H. sp. CLG4 进行了化学表观遗传学诱导发酵,对诱导后的次生代谢产物进行分离纯化得到6个化合物 (图1),化合物1~3、5和6为首次从滇重楼内生真菌中分离得到.研究表明,该方法为激活药用植物内生真菌,获取更多结构多样的天然产物提供了一定参考.
图1 CLG4表观遗传学诱导产生次生代谢产物结构
高效液相色谱Aglient 1200 (美国Aglient公司);Avance III HD 600 (德国Bruker公司);Avance III HD 800 MHz (德国Bruker公司);Agilent,ZORBAX SB-C18柱 (250 mm×9.4 nm, 5 μm, Aglient公司),LDZX-40B 立式自动电热蒸汽灭菌锅 (上海博讯实业有限公司医疗设备厂);SW-CJ-ZFD 型无菌操作台 (苏净集团安泰公司);HP-900 型隔水式恒温培养箱 (广东省医疗器械厂);ZHWY-2102 恒温培养振荡器 (上海智城分析仪器制造有限公司);SHZ-D (Ⅲ)循环水式真空泵 (巩义市英峪予华仪器厂);S20092819 型旋转蒸发仪 (上海亚荣).
柱层析法使用硅胶 (200~300目,青岛海事)、恩替诺特 (湖北信康医药化工有限公司)、RP-18凝胶 (40~63 μm,YMC)、乙腈 (色谱纯)、甲醇 (色谱纯)、马铃薯、葡萄糖、琼脂、娃哈哈纯净水、二氯甲烷、甲醇、石油醚、乙酸乙酯、丙酮(均为工业级)、DMSO为分析纯.
马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基 (PDA) (1L):葡萄糖 20 g,马铃薯 300 g,琼脂 18 g,蒸馏水 1 000 mL, 121 ℃ 灭菌 20 min,冷却备用.
马铃薯葡萄糖液体培养基 (PDB) (1L):葡萄糖 20 g,马铃薯 300 g,蒸馏水 1 000 mL, 121 ℃ 灭菌 20 min,冷却备用.
恩替诺特终浓度为 500 μmoL/mL.
野生重楼采自云南省呈贡区梁王山的野生重楼,经云南民族大学杜刚副教授鉴定为滇重楼(P.polyphyllavar.yunnanensis).经实验室分离鉴定,菌寄生属内生真菌 (H.sp. CLG4) 菌株从新鲜的重楼根部分离,且经分子克隆手段鉴定,其ITS NCBI登录号为:MT604986,菌株保存于云南民族大学民族药资源化学国家民委-教育部重点实验室.
将常温条件下保藏的菌株取出,经平板活化后备用.配制马铃薯葡萄糖液体培养(PDB),按照 10∶1 的接种量进行接种.于 30 ℃ 200 r/min 的条件下培养 3 d,将种子液分别接种2瓶 100 mL PDB培养基中,控制其他条件一致,空白组不加恩替诺特,实验组加入 100 μL 恩替诺特,培养 3 d.无菌条件下,取出 1 mL 菌液,乙酸乙酯萃取2次,每次 500 μL 乙酸乙酯,2次萃取的乙酸乙酯浓缩蒸干后用 100 μL 色谱甲醇溶解,12 000 r/min 离心 10 min,吸取上清 10 μL 进行HPLC分析 (0~ 30 min,乙腈10%~100%梯度;流速 1 mL/min,进样体积 10 μL).发现产生很多次生代谢产物,因此,以试验组同样条件扩大发酵 10 L.
发酵液 10 L,用多层纱布过滤,分离得到滤液和菌丝体.滤液用等体积的乙酸乙酯萃取6次,菌丝体用丙酮超声提取,提取液浓缩至无丙酮后所得的水相再用等体积乙酸乙酯萃取3次,合并两部分的乙酸乙酯萃取物,在 40 ℃ 下减压蒸馏得浸膏 15 g,经硅胶柱 (200~300目) 层析,分别以纯二氯甲烷、V(二氯甲烷)∶V(甲醇)=(100∶1、80∶1、60∶1、50∶1、30∶1、20∶1、10∶1、1∶1)、纯甲醇梯度洗脱,得到Fr.1~Fr.10,共10个组分.Fr.2以石油醚-乙酸乙酯溶剂体积比系统梯度洗脱,通过硅胶柱色谱反复纯化得到化合物3(12.2 mg).Fr.3以二氯甲烷-甲醇溶剂体积比系统梯度洗脱,通过硅胶柱色谱,RP-18反向柱反复纯化得到化合物1(109.0 mg),6(114.4 mg),4(19.5 mg),Fr.4以石油醚-乙酸乙酯溶剂体积比系统梯度洗脱,二氯甲烷-甲醇溶剂体积比系统梯度洗脱,通过硅胶柱色谱反复纯化得到化合物5(28.3 mg),2(10.1 mg).
利用恩替诺特对菌株进行表观遗传学筛选.对比空白组和实验组 (加入恩替诺特),HPLC在 210 nm 处检测发现菌株CLG4最敏感,如图2所示.
图2 CLG4代谢物HPLC分析图
对比上述2组实验结果,可以看出加入恩替诺特后,CLG4的代谢产物组成发生显著变化,产生新的产物峰1~6.
化合物2黄色固体,分子式C11H12O5,1H NMR(800 MHz,Acetone-d6)δ: 1.50 (3H,d,J=6.3Hz,3-CH3),2.87 (1H,m,H-4a),2.96 (1H,dd,J=16.2,3.2 Hz,H-4b),3.90 (3H,s,7-OCH3),4.72 (1H,m,H-3),6.53 (1H,s,H-5),11.05 (1H,s,8-OH).13C NMR (200 MHz,Acetone-d6)δ: 20.8 (CH3-3),34.6 (C-4),56.5 (OCH3-7),77.1 (C-3),103.0 (C-8a),103.2 (C-5),132 (C-7),133.7 (C-4a),151.1 (C-8),154.0 (C-6),170.9 (C-1).以上数据与文献[13]报道的数据基本一致,因此鉴定为6-demethylkigelin.
化合物5黄色固体,分子式C7H8O2,1H NMR(600 MHz,CD3OD)δ:6.58 (1H,d,J= 8.5 Hz,H-6),6.45 (1H,dd,J= 8.5,2.9 Hz,H-5),6.54 (1H,d,J= 2.9 Hz,H-3),2.12 (3H,s,CH3).13C NMR(150 MHz,CD3OD)δ:149.3 (C-1),126.5(C-2),116.4 (C-3),150.9 (C-4),113.9(C-5),118.4(C-6),16.4(CH3).以上数据与文献[15]报道一致,因此鉴定为pyrolin.
本实验采用组蛋白去乙酰化修饰剂恩替诺特(Entinostat)对滇重楼内生真菌CLG4(Hypomyces.sp)进行化学表观遗传诱导,发现与未诱导的滇重楼内生真菌有显著差别.对诱导后的菌株产生次生代谢产物分离纯化,得到6个化合物,化合物1~3,5和6为首次从该内生真菌代谢产物中分离得到.化合物2为terrein,它是青霉和曲霉真菌的著名代谢物,具有广谱的生物活性,如抗菌、抗肿瘤和酶抑制作用[13];化合物3为(3R)-6-methoxymellein,它是一种常见的植物抗毒素,由胡萝卜根产生,这种化合物具有广泛的抗菌谱,能抑制几种真菌的生长,如酵母菌和细菌[14];化合物4为(3R)-6,7-dimethoxymellein,它对人类病原真菌 (皮肤癣菌)、犬小孢子菌和长毛癣菌具有显著的抗真菌活性[14];化合物6为6-demethylkigelin,它能抑制生长[16].研究结果表明,化学表观遗传诱导方法,可使真菌的代谢产物类型发生显著改变,推测这是表观遗传修饰剂诱导改变真菌代谢途径的结果.表观遗传诱导为研究药用内生真菌在实验室培养条件下产生新的代谢产物提供了一定借鉴.