基于中性粒细胞弹力蛋白酶介导的通路研究地胆头干预慢性阻塞性肺疾病患者气道黏液高分泌及疗效观察

贾盼红，李 琪，熊晓嫚，周向东

(海南医学院第一附属医院呼吸内科，急救与创伤研究教育部重点实验室，海南 海口 570102)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD) 简称慢阻肺，以进行性加重、不完全可逆的气流受限为特点，临床常出现反复咳嗽、咳痰、发热，渐进性呼吸困难。疾病晚期常出现呼吸衰竭、肺性脑病、肺心病，极大危害患者生命，是全球致死率、致残率最高疾病之一。正常生理情况下，气道存在少量黏液，少量黏液在气道的先天性免疫过程中发挥极其重要作用，而过度黏液分泌会使纤毛清除功能受损，致使感染加重，且会加重呼吸道梗阻，致使气流受限进一步加重[1]，气道黏液高分泌是慢阻肺、支气管哮喘等疾病主要的病理生理特点[2]。目前，气道黏液高分泌已经成为导致慢阻肺高发病率、高死亡率的重要因素[3]。气道黏液高分泌的机制十分复杂，其信号通路由多种因素、多种物质共同参与，信号转导过程层层递进，之间又相互影响、相互交叉、相互作用[4]。目前,关于NE介导的信号转导通路研究较多，研究证实，慢阻肺病人气道分泌物中NE大量蓄积。NE为中性粒细胞激活后释放的一种可引起组织损伤的炎性毒性分子，其与慢阻肺发病及病情变化密切相关[5]。研究证实，NE是促进杯状细胞分泌黏液蛋白(MUC5AC)的最强因素[6],气道黏液高分泌主要源于的MUC5AC高表达。MUC5AC的高表达和杯状细胞增生是慢阻肺病人典型的病理特征，贯穿疾病始终[7]。本课题组前期实验采用NE特异性抑制剂西维来司钠对大鼠的慢性气道炎症模型进行实验干预，发现其可使大鼠气道黏液蛋白表达降低[8]。

地胆头(Elephantopus scaber Linn)又名苦地胆等，是中国长江以南常用的民间中草药，被《海南常见中草药名录》收录。地胆头具有清热解毒、抑菌等功效[9]。范琼等[10]发现地胆头主要成分为酚类、类黄酮物质，酚类、黄酮类物质是强的抗自由基物质[11]。本课题组在前期实验及临床观察证实地胆头明能够明显减少慢阻肺患者痰量，减少其急性加重次数，减少炎症因子的释放。但是否能够降低气道黏液高分泌，是否能够减少MUC5AC的分泌，以及是否与NE介导的通路相关尚不清楚。本研究通过检测地胆头治疗前后慢阻肺病人血清中NE及MUC5AC的表达，并观察肺功能(FEV1、FEV1/FVC)变化，观察其临床疗效，与对照组进行比较分析，旨在为慢阻肺气道黏液高分泌临床防治提供新思路及理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年10月～2019年6月在海南医学院第一附属医院确诊慢阻肺急性加重的住院病人160例，年龄55～74岁，平均 (58.86±4.52)岁；病程4～15年，平均 (10.25±2.66)年。采取随机数字表法将患者分为观察组和对照组，各80例。两组年龄、患病时间比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性；两组予以吸氧、抗感染、解痉、祛痰等基础治疗，观察组加用地胆头液4 mL雾化吸入，每天1次,每次15 min，治疗2周；同期选80名健康体检者为健康对照组。所有体检者FEV1/FVC大于70%。纳入标准：符合2017年慢阻肺诊治中国专家共识诊治标准的患者[12]；排除标准：患支气管扩张、哮喘、活动性肺结核、心功能不全等造成呼吸困难的疾病；近半年内曾使用免疫抑制剂、糖皮质激素等抗氧化剂；经本院伦理委员会许可，受试者自愿签定知情同意书。

1.2 主要仪器试剂

酶标仪(奥地利Anthosht公司)，超净工作台(山东博科有限公司)，高速低温离心机(美国Beckmancoulter公司)，地胆头液(广州市红十字医院赠)，人NE、MUC5AC试剂盒(中国上海酶联生物科技有限公司)。

1.3 标本采集及实验方法

入院时分别抽取观察组、对照组、健康对照组早晨空腹静脉血4 mL，治疗2周后抽取观察组、对照组早晨空腹静脉血4 mL，后置于离心机离心15 min(3 000 r/min)，分离血清，放入-80℃冰箱待测。ELISA检测观察组、对照组治疗前后及健康对照组NE、MUC5AC水平，严格按照试剂盒要求进行实验。

1.4 疗效观察

参照文献[12]中慢阻肺临床症状评分:活动耐力下降，胸闷加重记1分，咳嗽、咳痰加重，记1分，痰液更加黏稠或者有脓性改变，咳痰较前困难，记1分。显效:评分较诊疗前下降2～3分，有效:评分较诊疗前下降1分，无效：症状无减轻甚至加重。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 观察组和对照组治疗后疗效比较

治疗2周后，观察组总有效率大于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 观察组和对照组治疗后疗效比较[n=80,n(%)]Tab 1 Comparative analysis of clinical effects of patients in observation group and control group after treatment [n=80,n(%)]

2.2 各组血清NE、MUC5AC水平及肺功能FEV1、FEV1/FVC比较

与健康对照组比较，观察组和对照组治疗前血清中NE、MUC5AC表达明显增多，差异有统计学意义(P<0.05)；观察组治疗后血清NE、MUC5AC、FEV1、FEV1/FVC与观察组诊疗前比较，差异有统计学意义(P<0.05)；对照组治疗前后血清NE、MUC5AC、FEV1、FEV1/FVC比较，差异有统计学意义(P<0.05)；观察组治疗后血清NE、MUC5AC、FEV1、FEV1/FVC与对照组治疗后比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 各组血清NE、MUC5AC水平及肺功能FEV1、FEV1/FVC比较Tab 2 Comparison of serum levels of NE and MUC5AC measured by ELISA and lung function of

3 讨论

慢阻肺疾病是高发病率、高病残率、高死亡率的一种呼吸系疾病，WHO统计分析慢阻肺是世界范围内导致死亡的排名第4疾病，每年约有6亿患者受其困扰，且人数逐年增加[13]。研究证实，黏液糖蛋白、蛋白质及脂类3种物质组成了气道黏液。黏液可分成上下两层，上层为黏液层，其能够通过纤毛细胞的摆动，吸附空气中的微小颗粒物及致病菌，下层为浆液层，可润滑纤毛，保证黏液纤毛运动[14，15]。近些年，越来越多研究者关注慢阻肺患者气道黏液高分泌。气道黏液高分泌不仅能够加重气道梗阻，使肺功能急速下滑，还为细菌繁殖提供了良好培养基，致使抗菌药物的杀菌环境遭到严重破坏，导致气道感染难以控制及反复发作；且感染产生的炎性物质，又可以再一次使黏液高分泌，形成恶性循环。黏液高分泌与慢阻肺住院率密切相关，其已经成为发病率、死亡率居高不下危险因素[16-18]。因此，有效遏制气道黏液高分泌状态将成为防治慢阻肺可行新途径。NE是中性粒细胞所释放的炎症介质之一。正常情况下，NE可以保护机体免受感染的伤害，然而过量的NE能够破坏气道纤毛机构及功能，并大量降解胶原蛋白以及诱导杯状细胞及黏液下腺的增生、促进黏蛋白分泌[19]。目前研究证实，NE为最强的促黏液分泌因子，其可通过多种通路调控MUC5AC，包括氧自由基(ROS)、EGFR、TOLL样受体4信号通路，它们之间相互关联、相互交错[20]。抑制NE的活性，可明显抑制MUC5AC合成[21，22]。近年，研究者针对气道黏液高分泌开发了一些西药，但较多仍处于动物实验阶段。GOLD指南指出：慢阻肺稳定期ICS、LAMA、LABA联合使用可减少慢阻肺病人急性加重次数，提高其生活质量，可是因为药物昂贵，长期使用增加了患者的经济负担，且有增加肺炎、心血管疾病事件、股骨头坏死等相关不良影响，严重影响了慢阻肺病人长期治疗的依从性及临床疗效[23，24]。中草药可有效补充西药的不足之处，本课题组前期实验证明红茶中提取物茶黄素可有效改善气道黏液高分泌状态，其机制是通过抑制NE介导的MUC5AC含量及MUC5ACmRNA表达量所致，且与剂量依赖关系[25]。本课题组前期实验及临床观察证实地胆头能够有效抑制社区获得性肺炎炎症介质IL-6、IL-8、TNF-α的释放，改善肺炎患者咳嗽、咳痰症状，有效缩短住院时间，且无不良反应发生。

本研究采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测3组血清中NE、MUC5AC表达，研究发现慢阻肺病人血清中NE、MUC5AC明显高于健康体检组，提示慢阻肺病人NE介导的气道黏液高分泌MUC5AC通路被激活；给予地胆头液雾化治疗后，观察组体内NE、MUC5AC的表达明显降低；观察组、对照组治疗后血清中NE、MUC5AC存在明显差异(P<0.05)，经pearson相关性分析，NE、MUC5AC存在正相关关系，提示地胆头液抑制慢阻肺患者MUC5AC的分泌可能与NE介导的通路相关。地胆头组总有效率优于对照组，能够明显缓解症状，且无不良反应发生，值得推广。本研究有局限之处，仅提示地胆头抑制慢阻肺病人MUC5AC减少可能与NE介导的转导通路相关，下一步笔者将从基因及细胞层面进行更深层次地探索。